论文部分内容阅读
研究目的:前列腺癌抗雄治疗抵抗是疾病复发与进展的常见原因。我们的前期研究表明,肿瘤微环境与前列腺癌的耐药进展和肿瘤异质性分化关系密切,特别是其中的肿瘤相关巨噬细胞,可促进前列腺癌抗雄耐药和进展,但是,肿瘤与肿瘤微环境间作用环路对前列腺癌抗雄耐药进展的作用机制尚未完全阐明。同样,异质性分化的前列腺癌细胞,尤其是前列腺癌干样细胞,对肿瘤微环境也有重要的改造作用,但前列腺癌干样细胞对骨转移部位的肿瘤微环境——骨微环境的影响还未研究清楚。因此,本研究主要探索肿瘤与肿瘤微环境的调控环路对前列腺癌抗雄耐药进展及前列腺癌骨转移的作用,并着力阐明其潜在机制,以期为改善前列腺癌治疗效果及患者预后提供新思路。研究方法:本课题首先经临床标本免疫组化检测明确gankyrin的表达水平及与前列腺癌抗雄治疗抵抗及患者预后的相关性、以及观察前列腺癌干样细胞标志物OV6与前列腺癌骨转移的关系。体外实验中,主要利用共培养模型研究前列腺癌细胞与肿瘤微环境(含前列腺癌-骨微环境)的相互作用,细胞黏附实验模拟了前列腺癌在骨微环境的定植过程。并通过蛋白电泳,侵袭与迁移,酶联免疫吸附试验、流式细胞术、免疫荧光等研究前列腺癌恶性表型与肿瘤微环境的关系。在机制探索中,我们采用蛋白免疫共沉淀及质谱分析来明确蛋白间相互作用,通过抗体芯片筛选肿瘤微环境中关键作用因子。经染色质免疫共沉淀观察转录因子对下游基因转录的调控。体内实验中,裸鼠皮下移植瘤模型是验证联合靶向前列腺癌细胞与肿瘤微环境调控环路效果的可靠模型。胫骨原位移植瘤模型则较好的模拟了前列腺癌与骨微环境的相互作用。结果:(一)Gankyrin促进前列腺癌抗雄治疗耐药及进展并与前列腺癌患者预后正相关首先,在线数据库及临床标本检测发现gankyrin在前列腺癌中高表达。较未接受抗雄治疗组,gankyrin在抗雄治疗组标本中表达更高。Gankyrin表达也是患者生化复发早,无疾病进展生存期短等不良预后的预测指标。其次,在前列腺癌细胞中,gankyrin过表达可促进前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的抵抗,敲低gankyrin的效果则相反。最后,抗雄治疗组织中高表达的HMGB1,其表达及分泌受gankyrin调控。在过表达gankyrin的前列腺癌细胞中敲低HMGB1,可取消gankyrin促前列腺癌抗雄抵抗的作用。(二)前列腺癌通过Gankyrin信号通路与肿瘤相关巨噬细胞构筑相互作用网络促进前列腺癌抗雄治疗耐药首先,蛋白免疫共沉淀及质谱分析gankyrin结合蛋白,发现NONO蛋白可同时结合gankyrin及HMGB1,且NONO表达受gankyrin调控,而NONO下游转录因子AR可调控HMGB1转录。其次,gankyrin可驱化并激活的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs),活化的TAMs反过来可促进前列腺癌侵袭性增加及耐药。最后,HMGB1激活的TAMs可分泌IL6并激活下游STAT3,转录因子STAT3可促进前列腺癌中gankyrin转录。体内实验发现,联合靶向gankyrin通路及肿瘤相关巨噬细胞可有效缓解前列腺癌抗雄治疗耐药。(三)前列腺癌干样细胞与骨微环境中成骨细胞的相互作用网络促前列腺癌骨转移首先,前列腺癌干样细胞标志物OV6在骨转移患者组织中高表达。在动物模型中,骨转移部位也高表达OV6,且OV6~+组小鼠较对照组骨转移概率高,肿瘤增殖快。其次,与前成骨细胞共培养后的前列腺癌细胞OV6表达增加,OV6~+前列腺癌干样细胞经共陪养后,c-Myc、OCT4、CD44等前列腺癌干样细胞标志物表达增加,细胞成球能力及在骨微环境中的定植能力增强。前成骨细胞在共培养后成骨分化标志物表达增加。最后,经抗体芯片分析发现,IL11是OV6~+前列腺癌干样细胞与骨微环境相互作用的关键因子,IL11结合IL11R并激活STAT3通路,c-Myc一方面可促进前列腺癌干样细胞特性,另一方面可作为STAT3下游转录因子,结合IL11转录因子并促进其转录。结论:抗雄治疗后的前列腺癌高表达gankyrin,其与前列腺癌耐药进展及患者不良预后密切相关。前列腺癌中gankyrin激活下游NONO/AR通路,促进HMGB1转录及分泌。HMGB1招募并活化肿瘤相关巨噬细胞,TAMs继而促进IL6/STAT3信号通路激活,STAT3可进一步促进gankyrin转录,从而形成前列腺癌与肿瘤微环境间正反馈调控环路,体内实验证实靶向此正反馈环路可有效抑制前列腺癌ADT耐药。肿瘤微环境不仅可促进前列腺癌ADT耐药,骨转移部位特殊的前列腺癌-骨微环境与前列腺癌骨转移关系密切。PCa骨转移样本和小鼠骨转移标均本高表达前列腺癌干样细胞标志物OV6,PCa与骨微环境的相互作用一方面可促进PCa干样细胞特性和细胞定植能力增强。另一方面也能促进成骨细胞分化。IL11/STAT3/c-Myc环路是介导OV6~+前列腺癌干样细胞与骨微环境相互作用的信号通路,靶向此环路关键因子有望成为PCa骨转移治疗潜在靶点。