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羊传染性脓疱病(Orf)又称羊传染性脓疱性皮炎,是由羊口疮病毒(ORFV)引起的山羊和绵羊的一种急性、接触性传染病。易感羊群为3-6月龄的幼羊,多为群发,而成羊发病多为散发。羊口疮的典型特征是病羊口唇等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结成疣状厚痂。本病流行广泛,世界各地均有发生,在我国北方、西北等羊群较多的地方比较常见,是羊的主要疫病之一。羊口疮病毒(ORFV)为双链DNA病毒,属痘病毒科,副痘病毒属。ORFV基因组全长约135kb, G+C含量丰富(63%-64%),含131个预测基因。其中,病毒的基因组中部高度保守,在病毒复制和形态发生有重要作用,而两端区域变异较大,多与病毒的毒性,致病及免疫调节中发挥作用。羊口疮病毒(ORFV)被公认具有强大的宿主免疫调节功能。痘病毒对宿主的免疫调节作用主要是通过编码大量的免疫调节蛋白作用于宿主免疫或炎症反应通路来实现的。NF-κB信号通路是病毒对宿主免疫调节的一个重要靶点,该通路在病毒感染宿主致病的过程中起关键作用。课题组的前期研究发现,羊口疮病毒的新基因ORFV024是一个病毒早期基因,呈点状分布于细胞质中,与NF-κB信号通路有关,其编码蛋白均能抑制NF-κB活化。ORFV024虽然位于基因组中部,但与其它的痘病毒和细胞内蛋白同源性较低,羊口疮病毒不同毒株之间,以及羊口疮病毒与其他副痘病毒之间比较,其序列的变异都是较大的。将基因缺陷株OV-IA82Δ024与野生株OV-IA82同时感染OFTu细胞中,发现0RFV024不影响病毒的复制,但是,OV-IA82Δ024却可以明显降低细胞病变效应(CPE)。 ORFV024能抑制由NF-kappaB信号通路调节的细胞因子的升高,(IL-6,IL-8),抑制作用点位于NF-κB信号通路的上游,通过抑制IKKα和IKKβ的磷酸化来影响NF-kappaB信号通路。但是,系列实验证实ORFV024与IKKα和IKKβ没有直接的相互作用。所以ORFV024应该是作用于IKKs上游的其它环节,间接抑制IKKα和IKKβ的磷酸化。因此,本课题研究的目的是发现和验证NF-kappaB信号通路中与ORFV024相互作用的蛋白,进一步明确ORFV024调控NF-κB信号通路的分子机制。为保证整体实验研究的顺利进行,首先要解决羊口疮病毒的大量培养问题。ORFV可在牛、羊的皮肤细胞、肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸细胞上生长,并产生细胞病变,但这些细胞获取过程复杂,需要大量实验动物,成为研究ORFV的一个重要问题。为此,我们建立了分离效率高、增殖快、操作简单且可长期继代的培养羊口疮病病毒(ORFV)的原代细胞并进行了培养鉴定。首先是是羊胚胎鼻甲细胞的原代培养,在孕羊的腹部及子宫做手术剖口,取出胚胎备用。无菌取羊胚胎的鼻甲部位,胰蛋白酶消化,稀释成5×105个/ml的细胞接种液,100mm培养皿接种10ml细胞接种液,置CO2培养箱中培养,利用倒置相差显微镜观察细胞生长情况及形态变化。12h细胞已贴壁生长,呈梭形,72小时后细胞显著增多。对其生长曲线测定,发现其倍增时间为36h。ORFV-NA株感染OFTu,24h后可形成典型的细胞病变效应(CPE)。通过免疫荧光发现,病毒接种12h后,即可以检测到ORFV的增殖。12h内为病毒对细胞的适应期,病毒增殖缓慢；12-24h为病毒的快速增殖期,36-72h病毒效价增加缓慢。利用该细胞我们构建了OFTu文库,进行羊口疮病病毒的增殖及其外源基因表达的研究。筛选ORFV024的宿主相互作用蛋白,选用酵母双杂交系统,该系统在研究蛋白质之间的相互作用中应用广泛。首先,利用上述建立的OFTu细胞构建OFTucDNA文库。提取OFTu RNA,反转录为cDNA,合成单钵cDNA,经过PCR合成双链cDNA,然后共转化cDNA和线性pGADT-Rec载体到Y187酵母内,涂SD/-Leu平板,4-5天收取酵母克隆,加入到营养充足的液体培养基,分装然后冷冻保存备用。经鉴定,我们构建了0.57ML,细胞密度为7.5×107/ml,滴度为8.3×106cfu/ml的OFTU cDNA文库。然后,要构建ORFV024诱饵质粒载体,筛选OFTu细胞cDNA文库并寻找病毒蛋白ORFV024与宿主蛋白之间相互作用靶分子。024基因被克隆入pGBKT7载体中,经自激活及毒性实验鉴定后,在酵母细胞中表达,然后与OFTu文库融合,涂于缺乏亮氨酸及色氨酸的平板上初步筛选,挑取蓝色克隆于更为严格的培养基,缺乏亮氨酸,色氨酸,组氨酸及腺嘌呤再次筛选。在严格培养基中挑取呈现深蓝色斑的克隆,提取酵母质粒并测序。经筛选鉴定,共得到61个阳性克隆,通过DNA测序分析,其中包含11个蛋白序列。对11个序列蛋白都进行了生物信息学分析,发现其中两个蛋白：IGFBP6(insulin-like growth factor binding protein6)和LAGE3(L antigen family, member3)与NF-KB通路相关。进一步通过定位研究、His-Pull down实验、免疫共沉淀实验对ORFV-024与IGFBP6和LAGE3两蛋白的相互作用进行鉴定。通过基因克隆技术构建带有GFP标签的pEGFP-N1/IGFBP6和pEGFP-N1/LAGE3真核表达载体及带有Flag标签的pCDNA3.0-Flag/IGFBP6和pCDNA3.0-Flag/LAGE3,转染OFTu细胞,观察其定位,发现两蛋白与ORFV024在细胞中分布一致,其中IGFBP6弥散分布于细胞质中,而LAGE3分布于整个细胞中。将构建好的pCDNA3.0-Flag/IGFBP6和pCDNA3.0-Flag/LAGE3与pEGFP-N1/OFRV024共同转入OFTu细胞中,经过细胞免疫荧光染色后进行激光共聚焦分析,发现在OFTu细胞中,ORFV024与IGFBP6和LAGE3之间有空间上的重叠,提示可能具有相互作用。随后进行了His-Pull down实验。基因克隆技术构建pET32a/ORFV024原核表达载体,表达纯化,复性后,与His亲和凝胶结合2h,再分别对pEGFP-N1/IGFBP6和pEGFP-N1/LAGE3及pCDNA3.0-Flag/IGFBP6和pCDN A3.0-Flag/L AGE3真核表达蛋白进行Pull down, Western blot结果表明,024-HIS能与真核表达的LAGE3-GFP、LAGE3-Flag相互作用,但未观察到ORFV024与IGFBP6间的相互作用。Co-IP观察到相似的结果。293T细胞共转染pCMVTAG4A-024和LAGE3-GFP或IGFBP6-GFP或GFP,转染24h收细胞裂解,细胞裂解物用抗Flag抗体进行免疫共沉淀,细胞裂解物及免疫沉淀后样品进行SDS-PAGE电泳,再用抗GFP抗体进行Western blot分析,可见LAGE3-GFP与024-FLAG有相互作用,但IGFBP6-GFP与024-FLAG未观察到相互作用。综上所述,本课题成功建立了分离效率高、增殖快、操作简单且可长期继代的培养羊口疮病病毒(ORFV)的羊胚胎鼻甲细胞原代细胞,为羊口疮病毒的体外增值和致病机制的研究奠定了基础；成功构建了OFTu cDNA文库,为后续ORFV相互作用蛋白的研究提供了条件；筛选鉴定了ORFV024相互作用的宿主蛋白。采用酵母双杂交系统筛选获得11个基因序列,其中IGFBP6和LAGE3与NF-κB信号通路相关。通过激光共聚焦、His-Pull down、Co-IP试验证实ORFV024与LAGE3之间存在相互作用,ORFV024与IGFBP6之间的相互作用尚需进一步探索。这些研究结果可能为ORFV病毒控制以及预防治疗提供新的疫苗和佐剂靶标,也有助于开发对炎症性疾病和癌症有潜在的治疗价值的药物。