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一 研究背景及目的.半月板是膝关节内的纤维软骨组织,可以吸收振荡、传导膝关节的负荷、增加膝关节的稳定性并起到润滑关节的作用.半月板损伤是临床中骨科常见病,既往半月板损伤后均以半月板部分切除或全部切除的方法进行治疗,Smillie甚至建议,无论半月板撕裂程度如何,为了获得完整的半月板再生,均应行彻底的半月板切除术.方法:第1章骨髓基质干细胞的分离培养.1.1.方法.1.1.1.BMSCs分离:无菌条件下骨膜下切取其一段肋骨,长约3~4cm,PBS冲洗2遍,将切取的肋骨剪成0.5cm大小骨块,用含10％胎牛血清L-DMEM合成培养液10毫升注射器反复冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬浮液,接种在塑料培养瓶中,37℃、5%C0<,2>培养箱中培养.用含10%胎牛血清L-DMEM培养液冲洗犬肋骨骨髓腔,收集骨髓细胞悬浮液,接种在塑料培养瓶中培养.1.1.2.细胞接近融和时,弃培养液,加入0.125%胰酶(含0.01%EDTA)消化,收集细胞悬液,1000r/min离心,用用含10%FCS的L-DMEM合成培养液悬浮细胞,按1:2接种传代.1.1.3.BMSC克隆形成力测定:取细胞融合90%的BMSCs胰酶(含0.01%EDTA)消化成单个细胞悬液离心后加入L-DMEM培养液制成单个细胞悬液,计数细胞,然后以适量的细胞数接种于六孔板内,加入L-DMEM完全培养液,5%C0<,2>、37℃的培养箱中培养1周后,用瑞氏染色,计数每孔的细胞集落数(一般以50个以上细胞为一个集落).每次培养6孔,取平均值,计算克隆形成率.1.1.4.观测细胞生长曲线:取第3代细胞接种于24个直径为25mm的小培养皿中,置于37℃孵箱中培养.每天取4皿,连续取6 d,经胰酶-EDTA充分消化后离心,细胞密度记数,求出3皿的平均值.以细胞密度为纵坐标,绘出细胞生长曲线图.第2章体外bFGF和TGF-β1诱导骨髓基质干细胞分化为软骨样细胞.2.1.方法.2.1.1.bFGF预诱导骨髓间质干细胞取传至第3代的BMSCs消化后制成细胞悬液,采用密度为3~4×10<'6>的密度培养,用含10ug/L的bFGF的完全培养液预诱导48h.加含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的完全培养液预诱导24h.2.1.2 .TGF-β1体外诱导用含10ug/L的bFGF的完全培养液预诱导48h的BMSCs,更换成含10ng/m1 TGF-β1的完全培养液诱导,每2~3天更换培养液,至软骨细胞团块出现.2.1.3.倒置显微镜下隔日观察诱导细胞形态.2.1.4.将实验组培养板底所形成的细胞团块用PBS洗涤3次后用10%的中性甲醛固定30min,脱水、石蜡包埋后切片,分别进行阿新蓝、甲苯氨蓝染色检测软骨基质的分泌..2.1.6.免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.第3章聚羟基丁酸-戊酸酯(PHBV)载体体外细胞相容性研究.3.1.方法.3.1.1.犬骨髓基质干细胞体外培养和犬骨髓基质干细胞体诱导软骨细胞的方法同前.3.1.2.细胞悬液的制备将传至第3代及将融合的BMSC消化后形成细胞悬液,采用密度为3~4×10<'6>的密度细胞悬液备用,软骨细胞悬液制备方法同前.3.1.3.PHBV膜及支架准备采用发酵工艺方法制备(华南理工大学高分子材料系提供)孔隙率>85%,孔径大小分别为<100um、100~200um、200~350um的PHBV支架.PHBV支架按孔径和孔隙率不同分:A组;孔径50~100um,孔隙率85~95%.B组;孔径100~200um,孔隙率85~95%.C组;孔径200~350um,孔隙率85~95%.将其裁剪为0.5cm×1.2cm×1.4cm立方体备用.PHBV膜厚60~85um,将制得的PHBV膜剪成大小1cm×1.5cm备用.3.1.4. PHBV膜实验分组(1)BMSCs细胞悬液+PHBV膜组(2)诱导的软骨细胞悬液+PHBV膜组(3)BMSCs细胞悬液+诱导的软骨细胞悬液+PHBV膜组.3.1.5 .PHBV支架实验分组(1)BMSCs细胞悬液+PHBV支架组(2)诱导的软骨细胞悬液+PHBV支架组(3)BMSCs细胞悬液+诱导的软骨细胞悬液+PHBV支架组3.1.6.细胞接种在载体上体外培养收集第3~4代各组细胞,制成4×10<'5>/ML细胞悬液,接种于PHBV膜或PHBV支架培养,各组种植方法相同.3.1.7. PHBV膜和支架形态学观察及各组细胞在PHBV载体上生长情况倒置显微镜观察各组细胞在膜上及支架上生长状况.并于培养1,2,3周,HE染色后镜下记细胞数(PHBV膜)行t检验,进行统计学分析.结论:通过该实验的研究,可以得出以下结论:1.采用全骨髓培养法体外培养犬骨髓基质干细胞(BMSCs),方法简单易行,培养条件易控,连续培养三代后可分离出较纯化的BMSCs.2.BMSCs体外有很强的增殖能力,在体外可连续扩增传代8~9代,在最初的4~5代中BMSCs生长旺盛,增殖能力强,随着传代数的递增,BMSCs融合周期延长,细胞扩增能力下降.3.bFGF体外对BMSCs有显著的扩增作用,在一定的浓度范围内有着剂量依赖性.4.TGF-β1在体外可以诱导犬BMSCs向软骨细胞分化,分化的软骨细胞表型具备软骨细胞特点.经阿新蓝染色和甲苯氨蓝染色可见细胞核被染成蓝色,细胞和细胞之间有弥漫的紫红色异染性物质分布.采用软骨特异性的II型胶原进行鉴定结果显示II型胶原蛋白阳性表达形态完全符合细胞软骨的结构.5.联合叙贯应用bFGF和TGF-β1生长因子可成功诱导BMSCs分化为软骨细胞,较单一的诱导剂明显缩短诱导时间.6.PHBV体外细胞相容性实验显示其有良好的细胞相容性,对细胞无毒副作用,较好的生物力学性能,通过进一步的改良,可以作为组织工程化半月板的载体.7.骨髓基质干细胞+诱导软骨细胞混合要体外与PHBV载体结合,可能通过细胞间的及细胞与基质间的相互作用,细胞在载体上增殖生长更好,与对照组的显著性差导.