背景胃溃疡病(gastric ulcer,GU)是常见的消化系统疾病,病程较长,反复发作,长期不愈甚至可引起癌变,严重影响患者的日常生活与工作。GU发病机制复杂,目前认为该病是攻击因子与胃黏膜的防御因子失衡所致,其中胃酸、胃蛋白酶及幽门螺杆菌(helicobacter pylori,HP)感染在GU的发病中起主导作用。无论在何种病因导致的GU中,炎症反应及氧化应激损伤均是共同的参与者,并具有非常重要的作用,但探讨的深度远不如脓毒血症、糖尿病等炎症相关性疾病。其原因主要在于两方面:一方面,由于GU比这些全身性疾病轻,未引起学界的足够重视;另一方面,目前临床上对GU治疗的短期有效性让我们忽视了对GU机制的深入探讨。但我们必须意识到:1.HP耐药菌株的不断增多,使得GU的治疗难度日趋加大;2.尽管组胺-2受体拮抗剂(histamine H2 receptor antagonist,H2RA),质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,PPI),胃黏膜保护剂以及HP清除方案等的广泛应用,使GU很容易达到近期治愈的疗效,但复发率却相当高;3.HP根治时抗生素属全身性用药,这不仅造成肠道菌群的紊乱,也使得其他菌株对抗生素产生抗性,能够催生多种耐药菌株的形成为其他感染性疾病的治疗带来困难。4.缺乏针对促进胃黏膜屏障修复的药物。临床上此方面的药物,除米索前列醇、恩前列素外,再无它药。这也是现行疗法导致GU复发率高的重要原因。5.临床用药的一些副作用如PPI类药物所引起的细菌性肺炎,骨折等不可小视。因而,新的、高效安全的防治手段,仍是迫切所需。酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum,C.butyricum)又称酪酸梭状芽胞杆菌、酪酸菌、酪酸杆菌、丁酸梭状芽胞杆菌、丁酸杆菌、丁酸梭菌或丁酸菌,是一种革兰阳性厌氧内生芽孢杆菌。该菌是人和动物肠道的正常菌群,广泛存在于人与动物的肠道与粪便、奶酪及天然酸奶中,具有极强的整肠能力,调节肠道的微生态平衡。其预防和治疗腹泻、肠炎等疾病的作用已被广泛证实并应用于临床。C.butyricum的这些作用一方面来源于该菌对致病微生物的竞争性抑制,另一方面则基于其代谢产物的保护效应。C.butyricum的代谢产物,如丁酸、氢气、B族维生素等,均对人体有益,其中产量最多效应最强的是丁酸和氢气。丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要物质,对炎性肠病有显著疗效。丁酸对免疫细胞炎症反应的抑制作用,已在多个研究中心得到证实。氢气具有广谱的抗氧化、抗炎特性,在缺血再灌注损伤、脓毒血症、糖尿病等各种炎性疾病中都有较好的疗效。新近研究表明氢气对应激性GU也具有预防作用。C.butyricum对胃部炎性疾病作用的研究中,仅在停留在拮抗HP感染上,对GU本身是否有预防或治疗作用,具体通过何种机制仍未有研究涉及。乙醇、应激、胃蛋白酶、胃酸过多等均是导致GU的重要致病因素。在动物实验中,分别通过乙醇灌胃、水浸应激、幽门结扎、乙酸局部腐蚀等损伤方式模拟并复制GU模型。以上几种GU模型在评价和筛选GU治疗药物以及药物作用机制研究方面均发挥了重要的作用。本研究首先测定了 C.butyricum在消化道内及胃内的定植规律,然后通过在小鼠身上成功建立乙醇灼烧型、水浸应激型、幽门结扎型、乙酸局部腐蚀型GU模型,观测胃组织大体标本及病理组织结构变化,评价C.butyricum及代谢产物对各种急慢性GU的预防及治疗作用。本实验中,通过对胃组织内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力、CAT活力的检测以及白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白三稀 B4(leukotriene B4,LTB4)、6 酮前列腺素F-1α(6-keto-PGF-1α)的测定和胃组织内BAX和BCL2表达变化情况的判断,探讨C.butyricum对GU的效应机制。目的1.明确C.butyricum是否对GU具有预防作用;找到发挥效应的具体代谢产物及具体的效应机制。2.明确C.butyricum及丁酸是否对慢性GU具有治疗作用,并探索其疗效的具体机制。研究内容1.明确C.butyricum在小鼠消化道尤其是胃内的定植规律。2.建立各种急慢性GU模型 通过乙醇灼烧、水浸应激、幽门结扎、乙酸局部腐蚀型,复制相应的小鼠GU模型。3.C.butyricum胃黏膜保护效应研究 根据已确定的C.butyricum在胃内的定植规律,设定C.butyricum的预处理时间点,在乙醇灼烧、水浸应激,幽门结扎型等GU模型中,从大体形态、组织病理、氧化应激、炎症因子等多方面,评价C.butyricum的胃黏膜保护效应。4.C.butyricum代谢产物对胃黏膜保护效应及机制研究 以C.butyricum的代谢产物氢气和丁酸分别干预乙醇灼烧型GU模型,从大体形态、组织病理、氧化应激、炎症因子等多方面,评价其对胃黏膜的保护效应,并通过对免疫组化的方法检测BAX、BCL2表达量,对内在机制进行探索。5.C.butyricum和丁酸对GU治疗效应及机制研究 以C.butyricum和丁酸为治疗方式,在乙酸局部腐蚀型慢性GU模型上,从大体形态、组织病理、氧化应激、炎症因子等多方面,评价并探索C.butyricum和丁酸对GU的疗效及机制。方法1.取20只ICR小鼠灌菌3天后,每大杀2只取粪便与胃黏膜,分别进行细菌培养,并通过菌落形态、代谢产物等进行鉴定,通过菌量的计量,获取C.butyricum在消化道内和胃内的定植规律。2.通过乙醇灌胃、幽门结扎、束体水浸等方法模拟相应病因复制GU模型。根据前述实验得到的定植规律,在造模前4天完成灌菌处理,待菌在胃内定植高峰期时进行造模,取胃组织标本留检与模型对照组比较。3.利用C.butyricum的代谢产物丁酸和氢气对小鼠进行预先处理,在乙醇灼烧型GU模型上,观测两者的胃黏膜保护效应。4.在胃小弯局部肌层注射乙酸,复制慢性GU模型,并在造模3天后进行C.butyricum和丁酸治疗,7天后取胃并对C.butyricum和丁酸的疗效进行评价。5.以上实验所获得的标本,通过组织形态学检测,评价病理损伤程度。检测各组中胃组织的SOD、CAT活性及MDA含量;检测炎症因子IL-1β、TNF-α、LTB4、6-keto-PGF-1α的含量；测定幽门结扎模型的胃液的pH、胃蛋白酶活性及游离黏液量,探索C.butyricum及代谢产物对GU的预防和治疗效果及其内在机制。取C.butyricum代谢产物预防作用研究实验中的标本,通过免疫组化检测BAX,BCL2蛋白表达情况,探讨有效代谢产物预防作用的具体效应途径。6.计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),若方差齐,采用LSD法多重比较;若方差不齐,则采用Dunnent’s T3法多重比较。以0.05为小概率事件标准。结果1.C.butyricum在消化道内及胃内定植规律:结果显示经过连续三天的灌菌后,该菌能够在体内定植。(1)消化道内定植规律:灌菌后第1天粪便培养出的菌数量为9×107 CFU/g水平,以后足天增加第4天达到高峰1.62×1010 CFU/g水平,后逐天降低,在第8天后明显下降至4.7×106CFU/g水平,第9天后明显下降至104CFU/g水平以下。(2)胃内定植规律:该菌在灌注后第1天,胃内活菌菌量为9.6×107CFU/g,以后逐天增加,在第4天到高峰,菌量可达5.57×1010 CFU/g水平,随后逐渐下降,在第6天菌落降至,达4.1×106 CFU/g水平,第7天则明显下降至104CFU/g以下。C.butyricum在消化道内和胃内均可以定植,定植期分别为8天和6天,并且在灌菌后第4天均达到峰值。2.C.butyricum对各种GU的预防效果:(1)形态及病理变化:胃黏膜标本大体观察及病理切片结果显示,正常组:小鼠胃黏膜光滑完整,色淡红,未见充血水肿、糜烂出血,且胃黏膜层光滑均匀。胃腺细胞排列完整,黏膜下层基层排列完好。模型各组:可见胃黏膜颜色苍白,局部充血水肿,分布有大量点线状出血灶,上附有咖啡色血痂。胃壁四层结构层次清楚,黏膜上皮不完整,局部腺体结构紊乱,腺腔内较多脱落的上皮细胞碎片,胞浆染色浅,可见透明环状空晕;黏膜表层可见多处带状缺损,炎性细胞浸润。C.butyricum预防组:胃黏膜损伤较模型组明显减轻、黏膜层基本完好有少量脱落、细胞排列紧密、未见糜烂、出血及炎性细胞浸润。奥美拉唑组:胃上皮缺损范围小,腺体排列较整齐,腺腔内少量脱落细胞碎片,损伤程度与C.butyricum预防组相当。溃疡指数结果显示,C.butyricum可以显著降低小鼠各种GU模型的溃疡指数(P<0.01),C.butyricum预防与奥美拉唑组无显著差异。这些数据显示该菌对实验性GU具有显著的拮抗作用。(2)氧化还原指标:C.butyricum可以显著提高各种GU模型胃组织的SOD和CAT活力,降低MDA含量(P<0.01)。在幽门结扎模型上,C.butyricum预防组的SOD活力较奥美拉唑组为高(P<0.01),其余各指标与奥美拉唑组无明显差异;(3)炎症因子:C.butyricum组可以显著提高各GU模型胃组织6-keto-PGF-1α的水平;显著降低各GU模型IL-1β、TNF-α、LTB4含量(P<0.01),与奥美拉唑组相比无差异。(4)胃酸、胃蛋白酶及游离黏液:C.butyricum预防后能够提高胃液的pH,降低胃蛋白酶活性(P<0.05 or P<0.01),但程度上较奥美拉唑为弱(P<0.01)。而该菌能够明显提高游离黏液的量(P<0.01),甚至强于奥美拉唑(P<0.01)。C.butyricum预处理能够减轻胃黏膜病理改变,改善氧化应激及炎症,增加黏液分泌,降低胃酸和胃蛋白酶活性,对胃黏膜有保护作用。3.C.butyricum代谢产物氢气和丁酸对乙醇灼烧型GU的预防效果:(1)形态及病理变化:胃黏膜标本大体观察及病理切片结果显示,正常组:小鼠胃黏膜正常;模型组:损伤程度如前所述;丁酸治疗组:胃黏膜损伤较模型组显著减轻,镜下观察黏膜层完好,炎性细胞浸润数量极少。其病理改变,较奥美拉唑组为轻。氢气组:胃黏膜损伤程度与模型组基本相同,未见病理方面的改善,表明氢气无效。因而,后续的指标未检测。奥美拉唑组:胃上皮缺损范围小,腺体排列较整齐,腺腔内少量脱落细胞碎片。(2)氧化还原指标:丁酸可以显著提高各种GU模型胃组织的SOD和CAT活力,降低MDA含量(P<0.01);各指标变化与奥美拉唑组无差异,SOD活力甚至优于奥美拉唑组(P<0.01)。(3)炎症因子:丁酸组可以显著提高各GU模型胃组织6-keto-PGF-1α的水平;显著降低小鼠各GU模型IL-1β、TNF-α、LTB4含量(P<0.05 or P<0.01),6-keto-PGF-1α含量甚至优于奥美拉唑组(P<0.01)。(4)胃壁结合黏液量:丁酸预防后胃壁结合黏液量较模型组显著增加(P<0.01),而且也多于奥美拉唑组(P<0.05)。(5)BAX,BCL2的表达变化:正常组的两个蛋白均呈弱阳性表达;模型组的BAX表达量显著增加,呈强阳性,BCL2的表达并未发生明显变化;而丁酸预防组的BAX表达量较模型组明显下降,而BCL2的表达量则显著提高呈强阳性。奥美拉唑组该两种蛋白表达均较正常组无明显变化。氢气对乙醇灼烧型GU无效,而丁酸则有显著预防作用。丁酸能够减轻病理损伤,改善氧化应激和炎症反应,提高黏液产量,降低BAX/BCL2表达比例,抑制凋亡。4.C.butyricum及丁酸对乙酸腐蚀性GU的治疗效果:(1)病理变化:正常组:小鼠胃壁各层结构均正常。模型组:黏膜缺损明显可达肌层,出现少量再生腺细胞但紊乱排列,黏膜下层有一定量的炎性细胞浸润,毛细血管内血栓存在。C.butyricum治疗组:缺损减小,再生腺细胞密度不匀,膜下层炎细胞浸润,黏膜下血管未见明显病理改变。丁酸治疗组:黏膜基本完整,腺体细胞增生排列较整齐,数量较多:黏膜下层仅有少量的炎性细胞浸润。奥美拉唑组:溃疡处缺损较小,表面有新生腺细胞及上皮细胞,排列致密不整齐;黏膜下层可见炎细胞浸润,肌层有瘫痕纤维形成。(2)氧化还原指标:C.butyricum和丁酸可以显著提高GU处胃组织的SOD和CAT活力,降低MDA含量(P<0.01)。除丁酸治疗组CAT优于奥美拉唑组外(P<0.05),各指标基本与奥美拉唑组无明显差异。(3)炎症因子:C.butyricum和丁酸均可以显著提高GU处胃组织6-keto-PGF-1α 的水平;显著降低 IL-1β、TNF-α、LTB4(P<0.01),且 C.butyricum治疗组的各指标与奥美拉唑组相比无明显差异。丁酸治疗组的6-keto-PGF-1α、IL-1β、TNF-α均优于奥美拉唑组(P<0.05 or P<0.01),而LTB4则无差异。结论:1.C.butyricum能够在消化道内及胃内定植,并呈现一定规律。(1)消化道内定植规律:有效定植期为8天。(2)胃内定植规律:有效定植期为6天。虽然胃内和消化道内的C.butyricum定植天数不同,但均在第4天达到峰值。2.C.butyricum在乙醇、应激、幽门结扎造成的多种GU中,通过减轻氧化损伤,炎症反应,对胃黏膜损伤起到预防作用。3.C.butyricum通过丁酸对胃黏膜发挥保护效应,而氢气无此作用。丁酸可通过减轻氧化应激,炎症反应,增加黏液分泌,并上调BCL2/BAX表达比例,实现抗凋亡。4.C.butyricum及丁酸对乙酸局部腐蚀型GU均具有良好的治疗作用。抗氧化,抗炎是其治疗机制的重要部分。