糖尿病视网膜病变(diabetes retinopathy,DR)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)主要视网膜血管并发症,仍是导致许多国家DM患者失明的主要原因。DR发病机制较为复杂,目前国内外越来越多研究发现p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)相关通路的激活在 DR 发生发展中具有至关重要的作用。同时,DR在DM患者中较高的患病率、致残率,使患者、医者更清楚认知到DR早期防治的重要性、关键性。本研究在前期基础上,结合导师仝小林院士临床上治疗糖尿病微血管并发症的经验,采用益气通络方对无视网膜病变的1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)大鼠进行早期干预,从血糖脂代谢、氧化应激、炎症等整体层面和视网膜、胰腺组织病理学、β 细胞功能、血—视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)及 p38 MAPK相关通路等微观层面,多层面、多角度、多方位共同观察早期采用益气通络方对延缓T1DM大鼠视网膜病变的作用及探讨其内在机制,并比较益气通络方和活血通络方及分别联用胰岛素在改善T1DM大鼠视网膜病变中的差异,为在“态靶因果”、“早期治络、全程通络”思想指导下,提出益气温经通络法治疗T1DM“气虚络瘀”之态以防治DR提供科学依据,阐释科学内涵。研究目的:1.观察益气通络方在改善T1DM大鼠血糖、血脂、损伤胰岛组织、调节β细胞功能以及关键蛋白中的作用,从调节糖脂代谢紊乱、改善受损胰腺组织角度,探讨益气通络方延缓T1DM微血管并发症的整体作用及减轻胰腺损害,进而延缓DR发生发展;并比较益气通络方和活血通络方及分别联用胰岛素在改变以上指标中的差异。2.观察益气通络方在缓解T1DM大鼠血清、视网膜中氧化应激、炎症相关指标中的作用,整体与局部相结合,探讨益气通络方是否可以通过减轻T1DM大鼠氧化应激、炎症水平,延缓DR发生发展;并比较益气通络方和活血通络方及分别联用胰岛素在改变以上指标中的差异。3.观察益气通络方在减少T1DM大鼠视网膜伊文思蓝(Evans blue,EB)渗漏量、提高关键紧密连接表达、减轻视网膜病理形态的作用,探讨益气通络方是否可以通过改善BRB及视网膜组织损害,延缓DR发生发展;并比较益气通络方和活血通络方及分别联用胰岛素在改变以上指标中的差异。4.观察益气通络方在降低T1DM大鼠视网膜多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2,PRC2)、p38 MAPK、基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)表达的作用,探讨益气通络方是否可以通过调节PRC2/p38 MAPK/MMP-9/VEGFR通路,抑制视网膜毛细血管变性以及新生血管,从而延缓DR发生发展;并比较益气通络方和活血通络方及分别联用胰岛素在改变以上指标中的差异。研究方法:1.SPF级健康雄性SD大鼠210只,从中随机取25只作为正常组,其余大鼠一次性尾静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)45mg/kg诱导T1DM大鼠模型,将造模成功后的175只大鼠随机分为模型组、胰岛素组、胰岛素+羟苯磺酸钙组、益气通络组、胰岛素+益气通络组、活血通络组、胰岛素+活血通络组,每组25只。于造模成功后第二天开始灌胃给药,益气通络方、活血通络方灌胃用量分别为7、2 g/kg/d,羟苯磺酸钙为0.25 g/kg/d,胰岛素皮下注射1.5 IU/d,正常组、模型组大鼠给予等量蒸馏水灌胃,1次/d,连续给药12周。2.每两周测量大鼠体重以及随机血糖,于病程12周进行取材,检测相关指标。检测各组大鼠全血HbAlc,血清糖(FBG)、脂(CHO、TG、HDL-c、LDL-c、VLDL-c),观察各组大鼠糖脂代谢的差异;采用口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)、胰腺石蜡制片HE染色观察各组大鼠胰岛自细胞功能、病理形态的差异,Western blot检测胰腺中胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)、葡萄糖转运蛋白 4(glucose transporter 4,Glut-4)的表达,观察各组大鼠维持葡萄糖稳态关键蛋白的差异。3.ELISA法检测各组大鼠血清氧化应激指标(ROS、iNOS、NO、MDA,SOD、GSH、CAT)、炎症因子(TNF-α、IL-1β)水平,Western blot检测视网膜中NF-kB p65、TNF-a的表达,观察各组大鼠整体血清及局部视网膜氧化应激、炎症水平的差异。4.利用眼底照相及血管荧光造影、视网膜石蜡切片HE/PAS染色观察各组大鼠视网膜病理形态及血管病变的差异。5.采用伊文思蓝法检测各组大鼠EB渗漏量,Western blot、RT-PCR检测各组大鼠视网膜中ZO-1、Occludin、Claudin 5、VE-cadherin的表达,观察各组大鼠BRB以及关键紧密连接的差异。6.Western blot、RT-PCR 检测各组大鼠视网膜中 PRC2、EZH2、SUZ12、EED、p38 MAPK、MMP-9、VEGFR 表达,观察各组大鼠 PRC2/p38 MAPK/MMP-9/VEGFR 通路蛋白、mRNA表达的差异。研究结果:1.对T1DM大鼠体重、糖脂代谢及胰腺的影响:(1)与正常组大鼠相比,模型组大鼠一般状态较差,体重明显下降而后缓慢上升,差异有统计学意义。与模型组相比,各用药组均不同程度改善了 T1DM大鼠一般状态,胰岛素组效果最优,两方联用胰岛素优于两方单用。与模型组相比,胰岛素组大鼠各时间段体重增长幅度明显上升,差异有统计学意义,其余用药组无差异。(2)与正常组大鼠相比,模型组大鼠随机血糖增长幅度明显增大,糖指标(HbA1c、FBG)明显升高,差异有统计学意义。与模型组相比,胰岛素+活血通络组于用药2周时有明显降糖作用,除两方单用组、胰岛素+活血通络组外,其余用药组均于4周时呈现降糖效果;12周时除胰岛素+益气通络组、活血通络组,其余用药组均有明显的降糖作用,其中胰岛素组、胰岛素+益气通络组降糖效果最优,差异有统计学意义;整体而言,6组用药组随机血糖增长幅度均螺旋式下降。与模型组相比,各用药组不同程度降低了 HbA1c,其中胰岛素组、胰岛素+羟苯磺酸钙组均明显降低,差异有统计学意义。与模型组相比,各用药组降低FBG,差异无统计学意义。(3)与正常组大鼠相比,模型组大鼠脂指标(CHOL、TG、HDL-c、LDL-c、VLDL-c)明显升高,差异有统计学意义。与模型组相比,胰岛素组CHOL、HDL-c、LDL-c、VLDL-c明显下降,胰岛素+羟苯磺酸钙组CHOL、LDL-c、VLDL-c明显下降,胰岛素+益气通络组CHOL、LDL-c、VLDL-c明显下降,胰岛素+活血通络组CHOL、LDL-c、VLDL-c明显下降,差异均有统计学意义,其中两方联用胰岛素组明显优于两方单用组,胰岛素+益气通络组降脂效果最优。(4)与正常组大鼠相比,模型组大鼠血糖曲线下面积(area under curve,AUC)升高,差异有统计学意义。与模型组相比,除胰岛素组外,各用药组AUC均降低,差异无统计学意义。(5)HE染色:与正常组大鼠相比,模型组大鼠胰岛萎缩,胰岛细胞分布杂乱,一侧细胞增生,核密集排列。除胰岛素组外,各用药组在不同程度上改善了损伤胰岛细胞,萎缩程度变轻,胰岛细胞分布较规则。(6)与正常组大鼠相比,模型组大鼠IRS-1、Glut-4蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义。与模型组相比,各用药组IRS-1、Glut-4蛋白表达均明显升高,差异有统计学意义。其中,两方联用胰岛素明显差于两方单用,胰岛素与羟苯磺酸钙联用最优,益气通络组次之。2.对T1DM大鼠氧化应激及炎症的影响:(1)与正常组大鼠相比,模型组大鼠血清ROS、iNOS、NO、MDA均明显升高,差异有统计学意义。与模型组相比,除益气通络组MDA外,各用药组ROS、iNOS、NO、MDA均明显下降,差异均有统计学意义。整体而言,两方联用胰岛素明显优于两方单用,胰岛素+活血通络组效果最优,胰岛素及联用羟苯磺酸钙次之。(2)与正常组大鼠相比,模型组大鼠血清SOD、CAT明显降低,差异有统计学意义。与模型组相比,各用药组均提高了 SOD、GSH、CAT水平。(3)与正常组大鼠相比,模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β明显升高,差异有统计学意义。与模型组相比,各用药组两指标均明显下降,差异有统计学意义。其中,两方联用胰岛素明显差于两方单用,胰岛素效果最优。(4)与正常组大鼠相比,模型组大鼠视网膜TNF-a蛋白表达明显上升,差异有统计学意义,NF-kB p65蛋白表达略升高。与模型组相比,胰岛素组、益气通络组TNF-a蛋白表达明显下降,差异有统计学意义。3.对T1DM大鼠视网膜病理形态的影响:(1)与正常组大鼠相比,模型组大鼠晶体混浊,眼底四周模糊,视网膜静脉直径增宽,动静脉之比变小。各用药组大鼠晶体混浊、视网膜静脉直径增宽得到了不同程度地缓解。(2)HE染色:与正常组大鼠相比,模型组大鼠视网膜变薄,各层细胞排列疏松且不规则,内界膜肿胀、增厚,色素上皮细胞增生。各用药组不同程度减轻了视网膜病理变化,各层细胞排列较规则,内界膜变薄、肿胀减轻,色素上皮细胞增生减少。(3)PAS染色:与正常组大鼠相比,模型组大鼠内界膜肿胀、增厚,毛细血管扩张、充血,血管内皮细胞明显增生,周细胞减少。各用药组视网膜内界膜较薄,毛细血管扩张、充血减轻,血管内皮细胞减少。4.对T1DM大鼠BRB的影响:(1)与正常组大鼠相比,模型组大鼠EB渗漏量明显升高,差异有统计学意义;与模型组相比,各用药组EB渗漏量均下降。其中,两方联用胰岛素与两方单用疗效接近。(2)与正常组大鼠相比,模型组大鼠Z0-1、Occludin、VE-cadherin蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义。与模型组相比,各用药组Occludin、Claudin 5、VE-cadherin蛋白表达均明显升高,差异有统计学意义。胰岛素+羟苯磺酸钙组、胰岛素+益气通络组效果最优。(3)与正常组大鼠相比,模型组大鼠Occludin、Claudin 5 mRNA表达均明显降低,差异有统计学意义。与模型组相比,除活血通络组Claudin 5 mRNA表达明显降低外,各用药组Occludin、Claudin 5 mRNA表达均明显升高,差异有统计学意义。其中,单用胰岛素效果最优。5.对T1DM大鼠p38 MAPK相关通路的影响:(1)与正常组大鼠相比,模型组大鼠EZH2、SUZ12、EED、p38 MAPK、MMP-9、VEGFR蛋白表达均升高,差异有统计学意义。与模型组相比,各用药组EZH2、SUZ12、EED、p38 MAPK、MMP-9、VEGFR蛋白表达均下降。整体而言,胰岛素+益气通络组效果最优,益气通络组次之,胰岛素组效果最差。(2)与正常组大鼠相比,模型组大鼠视网膜中EZH2、SUZ12、EED、p38 MAPK、MMP-9、VEGFR mRNA表达明显升高,差异均有统计学意义。与模型组相比,除胰岛素组外,各用药组均不同程度降低了以上指标mRNA表达水平。整体而言,两方联用胰岛素组明显差于两方单用组,活血通络组效果最优,胰岛素组最差。研究结论:1.T1DM大鼠于病程12周时,视网膜组织发生病理性改变,BRB破坏,已出现早期视网膜病变。2.T1DM大鼠造模成功同时给予中西医不同干预方式,以早期防治DR发生发展。胰岛素与益气通络方联用在改善BRB损害、提高视网膜紧密连接、抑制p38 MAPK相关通路(即PRC2/p38 MAPK/MMP-9/VEGFR)方面效果最优,是早期防治T1DM大鼠视网膜病变的内在机制。3.胰岛素与益气通络方联用改善T1DM大鼠视网膜病变作用优于益气通络方单用、活血通络方及其联用胰岛素,为在西医降糖治疗基础上联用中医益气活血通络法,对T1DM患者进行整体辨证治疗,并进行早期干预以防治DR提供实验依据。4.胰岛素与益气通络方联用可调节T1DM大鼠糖脂代谢,改善胰腺损害,抑制炎症及氧化应激,可能是防治DR发生发展的另一原因。5.单用胰岛素虽能明显降糖,改善炎症及氧化应激,但在改善BRB损害、提高视网膜紧密连接、抑制p38 MAPK相关通路方面明显次于胰岛素与益气通络方联用,证实了单纯采用胰岛素降糖不能完全延缓DR发生及恶化程度。