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研究目的及背景：抗肿瘤血管生成治疗是目前生物医学研究领域新兴的前沿学科，研究开发的方向广泛涉及到肿瘤血管生成的各个方面。本课题所研究的对象为Tie-2受体，它特异性表达于血管内皮细胞和某些造血祖细胞细胞膜上，和VEGF的受体(Flk-1／KDR、Flt-1)一样同属酪氨酸激酶型受体家族。促血管生成素(Angiopoietin)为Tie-2受体的特异性配体。Tie-2受体在胚胎时期血管内皮呈均匀表达；在成年动物，Tie-2主要表达于肺血管内皮以及卵泡、创口肉芽组织等血管生成活跃的组织中，尤其在肿瘤周围的新生血管区、肿瘤和炎性细胞浸润的交界区表达最强，因此被认为在肿瘤等病理生理现象中发挥着重要的作用。Lin等构建了带有Tie-2受体胞外片断(ExTie-2)基因序列的腺病毒载体，用以在鼠体内产生可溶性Tie-2受体片断蛋白(ExTek蛋白)，实验表明：经静脉推注腺病毒载体2d后，血浆中ExTek蛋白的浓度达1mg／mL，而且维持了8d，2个肿瘤模型鼠乳腺癌和黑色素瘤的体积分别被抑制了64％和47％。Gelareh Zadeh和N．J．Deb等在星状细胞癌和Lewis肺癌肿瘤模型中也证实了ExTek抑制肿瘤生长的作用。而罗彦等构建含鸡Tie-2受体胞外片断的质粒，通过大肠杆菌表达并诱导Tie-2受体胞外片断蛋白的表达，并将目的蛋白进一步纯化、复性并免疫小鼠，获得抗血清，通过分离纯化获得鼠抗鸡Tie-2抗体。体外细胞培养结果显示该抗体能明显的诱导血管内皮细胞凋亡。在进一步的研究中，他们使用藻酸盐包裹此抗体治疗小鼠移植瘤实验表明能显著降低肿瘤新生血管的形成；CD31微血管计数显示此抗体能明显减少肿瘤内微血管数。我们研究的目的是初步探索真核表达质粒在动物体内表达的ExTek蛋白的生物学活性，为进一步深入研究Tie-2受体分子的功能及其抗体的临床应用奠定基础。材料和方法：第一部分：pcDNA 3．1+ExTie-2(鼠)质粒由四川大学华西医院生物治国家重点实验室构建(文艳君老师惠赠)，利用大肠杆菌DH5α扩增并提取pcDNA 3．1+ExTie-2(鼠)质粒，经过酶切、电泳、测序以及NCBIBlast鉴定所获得的质粒是否准确无误。然后通过Lipofectamine脂质体介导法将质粒转染入人胃癌SGC-7901细胞株，筛选出稳定表达的克隆，并利用细胞爬片免疫组化染色及Western blot检测其体外表达ExTek蛋白的情况。第二部分：建立人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型。将16只裸鼠分为五组，其中A、B、C、D四组在右上肢皮下注射人胃癌SGC-7901细胞悬液4×10~6个，建立裸鼠皮下移植瘤模型。A组干预方案为pcDNA3．1+ExTie-2(鼠)质粒局部注射+5Fu腹腔注射；B组干预方案为pcDNA3．1+ExTie-2(鼠)质粒局部注射；C组干预方案为5-Fu腹腔注射；D组为阴性对照组，干预方案为同等剂量生理盐水局部注射+腹腔注射。以上四组干预时间为：皮下注射细胞后的第14天，第21天，第28天和第34天。E组裸鼠皮下注射经转染pcDNA 3．1+ExTie-2(鼠)质粒的人胃癌SGC-7901细胞4×10~6个，E组无后期干预方案。所有裸鼠均在同等条件下饲养36天后测量肿瘤大体标本的体积并利用CD31免疫组化染色间接测定平均血管密度(MVD)，进而确定ExTek蛋白在体内有无抑制肿瘤血管生长的生物活性。结果：本实验中准确无误的提取到pcDNA3．1+ExTie-2(鼠)质粒。应用Lipofectamine脂质体介导法转染细胞成功后，通过G418筛选获得了体外稳定表达Tie-2受体胞外片断蛋白的SGC-7901细胞株。细胞爬片免疫组化染色及Western blot实验结果表明，通过转染pcDNA 3．1+ExTie-2(鼠)质粒，人胃癌SGC-7901细胞能稳定表达ExTek蛋白，而对照组中未经转染质粒的SGC-7901细胞则无此蛋白表达。裸鼠移植瘤模型研究结果显示：使用Tie-2受体胞外片断蛋白干扰肿瘤血管的生长的实验组肿瘤体积明显小于单用5-Fu化疗组，以及NS对照组，并具有统计学意义(p＜0．05)；通过CD31免疫组化染色间接测定MVD值结果显示：Tie-2受体胞外片断蛋白干预组肿瘤的结构更加紊乱，而且MVD值小于单用5-Fu化疗组，以及NS对照组，并具有统计学意义(p＜0．05)。结论：真核表达质粒pcDNA 3．1+ExTie-2(鼠)能够在SGC-7901胃癌细胞株中表达Tie-2受体胞外片断蛋白，并可能在体内通过干扰促血管生成素／Tie-2受体通路，起到抑制血管生成的作用，可以作为以后研究该受体通路的机制甚至是开发新型抗肿瘤血管生成药物的基础。