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氰酸盐促进肾小管上皮细胞上皮-间质转化的研究
各种病因导致的慢性肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)逐步发展成终末期肾脏病(End stage of renal disease, ESRD)的共同病理途径是肾脏纤维化[1].肾间质纤维化是肾脏纤维化病理特征中的一种,其病理生理机制复杂,有多种信号通路和细胞因子参与,涉及到炎症反应、氧化应激、免疫损伤等多个环节,这些病理环节相辅相成,共同促进肾脏纤维化的发生发展.大量研究表明,肾小管上皮细胞上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肾小管间质纤维化关键的发病机制之一[2, 3].同时也有研究显示,转化生长因子-β(Transforming growth factor-β, TGF-β)是通过活化多条信号通路触发肾小管上皮细胞上皮-间质转化的主要细胞因子,其中与肾纤维化关系最密切的是Smads通路[4].
近年来,高浓度尿素在体内的病理作用被人们逐渐认识,其通过诱导ROS产生与慢性肾病伴发的动脉粥样硬化[5]、胰岛素抵抗的发生密切有关[6].高浓度尿素可诱导小鼠体内外肾内髓细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量产生,造成蛋白质、脂质及DNA损伤,促进慢性肾脏病患者的肾功能逐渐恶化[7].氰酸盐(cyanate)是尿素非酶促反应的水解产物,在慢性肾脏病患者体内的浓度较高[8].Cyanate通过氨甲酰化改变蛋白质的构象,形成氨甲酰化血红蛋白、白蛋白、脂蛋白等,这些氨甲酰化蛋白是引发CKD伴动脉粥样化硬化的重要病理机制[9].同时有研究指出,氰酸盐自身可直接通过氧化应激导致血管内皮功能紊乱,从而启动动脉粥样硬化的病理过程[10].由此可见,氰酸盐作为体内循环的物质可作用于全身器官和各个系统.而肾脏是小血管分布特别密集的器官,血浆中氰酸盐水平的升高是否对肾脏本身造成损伤,进一步恶化肾脏功能,促使肾纤维化的发生是值得探讨的问题.
结合氰酸盐在其它系统的作用机制,我们推测慢性肾脏病患者血液中氰酸盐浓度的增高可能直接刺激肾小管上皮细胞,并触发上皮-间质转化,从而加速肾脏纤维化,在此过程中可能会伴有氧化应激的发生及TGF-β的改变.
目的
以人肾小管上皮细胞(HK-2)为研究对象,采用不同浓度的氰酸盐负荷.观察不同浓度氰酸盐对肾小管上皮细胞活力,活性氧的产生和TGF-β表达的影响,并探讨其上皮-间质转化的标志物表达水平的改变,为寻找肾纤维化的关键作用靶点提供研究线索和实验依据.
方法
氰酸盐作用于人肾小管上皮细胞(HK-2),CCK8法检测细胞活力;倒置显微镜观察细胞形态的改变;DCFH-DA法检测细胞ROS水平;细胞免疫荧光和Western blot分别检测E-cadherin、Fibronectin、α-SMA的表达.Western blot检测TGF-β的表达水平.
结果
1.倒置显微镜结果显示:1 mmol/L的氰酸盐导致个别细胞表面突起呈三角形;当氰酸盐的浓度达到2 mmol/L时,细胞数量明显减少,皱缩细胞增多,大部分细胞表面突起伸长呈梭形.
2. CCK-8结果显示:低浓度氰酸盐(0.25、0.5、1 mmol/L)负荷导致细胞活力水平略有下降,但无显著差异;当氰酸盐的浓度达到2 mmol/L时,细胞活力水平下降至56%左右,具有显著性差异(P<0.05).
3. DCFH-DA法检测细胞ROS水平:随氰酸盐浓度的增强,HK-2细胞内ROS水平逐渐升高,1 mmol/L氰酸盐(P<0.05)和2 mmol/L氰酸盐组的ROS水平具有显著差异(P<0.01).
4.Western blot检测EMT标志物:0.5 mmol/L氰酸盐负荷即可引起HK-2细胞中上皮细胞标志物E-cadherin的表达水平下降(P<0.05),表达水平不受氰酸盐浓度的影响.与此同时,Fibronectin和α-SMA的表达水平从0.5 mmol/L氰酸盐开始随负荷浓度增加而表达水平增强, Fibronectin表达水平增加在 1 mmol/L 氰酸盐浓度时具有明显差异(P<0.05),2 mmol/L氰酸盐浓度时具有显著性差异(P<0.01);α-SMA表达增加在2 mmol/L氰酸盐浓度时具有统计学差异(P<0.05).
5.细胞免疫荧光检测EMT标志物:正常组细胞中Fibronectin、α-SMA的未见荧光信号,E-cadherin红色荧光信号强烈,均匀分布于胞浆中;氰酸盐组细胞中E-cadherin红色荧光信号明显降低,而胞浆中Fibronectin、α-SMA的荧光信号显著增强.
6.Western blot检测TGF-β的水平:在1 mmol/L氰酸盐浓度时具有明显差异(P<0.05),2 mmol/L氰酸盐浓度时具有显著性差异(P<0.01).
结论
氰酸盐作用于人肾小管上皮细胞后引起细胞形态和活力的改变,伴随着ROS表达升高,多种EMT标志物以及TGF-β的表达上调,且呈浓度依赖性.以上结果提示氰酸盐触发肾小管上皮细胞的上皮-间质转化,通过TGF-β过表达从而加速肾纤维化.
血液透析病人血浆中LL-37 与抑郁状态的研究
精神疾病在慢性肾病(CKD)患者中极为常见,包括抑郁症,痴呆症,谵妄症,焦虑症,人格障碍和药物滥用,其中抑郁症是终末期肾病ESRD患者最常见的精神问题[1].抑郁症的症状分为认知和躯体症状.抑郁症的躯体症状与尿毒症的症状非常相似,如厌食症,睡眠障碍,疲劳,胃肠道疾病[1-3].这些相似之处使得对血液透析合并抑郁状态的认识变得困难.与此同时,在不同研究中,针对不同人群采用不同的评估工具,使得CKD患者的抑郁症患病率差异很大[2].一些研究报道了患病率高达30%[1-3].因此,如果能找到一种客观评价的指标,结合各种量表等评估工具,对于CKD合并抑郁状态的诊断具有重要意义.
抑郁症的病因复杂,目前尚无明确的病理生理机制,主要涉及到有以下假说,如单胺假说、下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)调节异常假说等.由于CKD本身是涉及多系统、多器官的疾病,而这类复杂疾病的机制都涉及到免疫因素.并且目前研究证明抑郁症的发生机制与免疫紊乱有密切关系[4].
LL-37是人体内唯一一种有效的抗菌肽,由免疫细胞生成释放入血.最近的研究结果强调LL-37除了杀菌作用外,调节免疫系统功能,并作为先天和适应性免疫反应之间的桥梁,因此参与各种生理和病理过程[5, 6].有研究表明它参与了自身免疫性疾病的病理生理过程[7].最近的一项研究显示LL-37水平与老年女性抑郁症状之间存在相关性[8].因此从免疫的角度去探讨透析病人抑郁发生与免疫紊乱之间的关系是具有主要价值.
目的
本文招募32位透析伴抑郁状态患者,33位透析未伴抑郁状态患者,32位健康未伴抑郁状态的志愿者.采集病史、血清、相关的临床资料,血清进行ELISA实验,并对结果统计分析,找出抑郁状态与血浆LL-37水平的相关性.
方法
在这项研究中,2013年6月至2015年12月期间,从重庆医科大学附属第二医院招募了32名伴有抑郁症状的HD患者和33名未伴抑郁症状的HD患者(HDND).同时,随机选择32名健康志愿者(HV)作为对照组.本研究采用汉密尔顿抑郁评定量表(HAMD)评估抑郁状态,为确保抑郁症状的准确性,将HD患者分为两组;评分为0-17的患者纳入非抑郁组,而评分超过17的患者则纳入抑郁组.采集血样后,离心获得血清,取上清液存于标记好的EP管中,分析前储存在-80℃冰箱.使用ELISA试剂盒评估血清中LL-37的浓度.所有检测值重复三次并进行统计分析结果,P<0.05被认为具有统计学意义.
结论
与未伴抑郁症状的HD患者相比,具有抑郁症状的HD患者的血清LL-37显着升高.调整后的多变量回归分析显示,年龄,文化程度,尿素水平和肌酐水平是抑郁症状的重要预测因素.血清LL-37水平和HAMD评分之间呈正相关(R=0.292, P=0.009).
各种病因导致的慢性肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)逐步发展成终末期肾脏病(End stage of renal disease, ESRD)的共同病理途径是肾脏纤维化[1].肾间质纤维化是肾脏纤维化病理特征中的一种,其病理生理机制复杂,有多种信号通路和细胞因子参与,涉及到炎症反应、氧化应激、免疫损伤等多个环节,这些病理环节相辅相成,共同促进肾脏纤维化的发生发展.大量研究表明,肾小管上皮细胞上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肾小管间质纤维化关键的发病机制之一[2, 3].同时也有研究显示,转化生长因子-β(Transforming growth factor-β, TGF-β)是通过活化多条信号通路触发肾小管上皮细胞上皮-间质转化的主要细胞因子,其中与肾纤维化关系最密切的是Smads通路[4].
近年来,高浓度尿素在体内的病理作用被人们逐渐认识,其通过诱导ROS产生与慢性肾病伴发的动脉粥样硬化[5]、胰岛素抵抗的发生密切有关[6].高浓度尿素可诱导小鼠体内外肾内髓细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量产生,造成蛋白质、脂质及DNA损伤,促进慢性肾脏病患者的肾功能逐渐恶化[7].氰酸盐(cyanate)是尿素非酶促反应的水解产物,在慢性肾脏病患者体内的浓度较高[8].Cyanate通过氨甲酰化改变蛋白质的构象,形成氨甲酰化血红蛋白、白蛋白、脂蛋白等,这些氨甲酰化蛋白是引发CKD伴动脉粥样化硬化的重要病理机制[9].同时有研究指出,氰酸盐自身可直接通过氧化应激导致血管内皮功能紊乱,从而启动动脉粥样硬化的病理过程[10].由此可见,氰酸盐作为体内循环的物质可作用于全身器官和各个系统.而肾脏是小血管分布特别密集的器官,血浆中氰酸盐水平的升高是否对肾脏本身造成损伤,进一步恶化肾脏功能,促使肾纤维化的发生是值得探讨的问题.
结合氰酸盐在其它系统的作用机制,我们推测慢性肾脏病患者血液中氰酸盐浓度的增高可能直接刺激肾小管上皮细胞,并触发上皮-间质转化,从而加速肾脏纤维化,在此过程中可能会伴有氧化应激的发生及TGF-β的改变.
目的
以人肾小管上皮细胞(HK-2)为研究对象,采用不同浓度的氰酸盐负荷.观察不同浓度氰酸盐对肾小管上皮细胞活力,活性氧的产生和TGF-β表达的影响,并探讨其上皮-间质转化的标志物表达水平的改变,为寻找肾纤维化的关键作用靶点提供研究线索和实验依据.
方法
氰酸盐作用于人肾小管上皮细胞(HK-2),CCK8法检测细胞活力;倒置显微镜观察细胞形态的改变;DCFH-DA法检测细胞ROS水平;细胞免疫荧光和Western blot分别检测E-cadherin、Fibronectin、α-SMA的表达.Western blot检测TGF-β的表达水平.
结果
1.倒置显微镜结果显示:1 mmol/L的氰酸盐导致个别细胞表面突起呈三角形;当氰酸盐的浓度达到2 mmol/L时,细胞数量明显减少,皱缩细胞增多,大部分细胞表面突起伸长呈梭形.
2. CCK-8结果显示:低浓度氰酸盐(0.25、0.5、1 mmol/L)负荷导致细胞活力水平略有下降,但无显著差异;当氰酸盐的浓度达到2 mmol/L时,细胞活力水平下降至56%左右,具有显著性差异(P<0.05).
3. DCFH-DA法检测细胞ROS水平:随氰酸盐浓度的增强,HK-2细胞内ROS水平逐渐升高,1 mmol/L氰酸盐(P<0.05)和2 mmol/L氰酸盐组的ROS水平具有显著差异(P<0.01).
4.Western blot检测EMT标志物:0.5 mmol/L氰酸盐负荷即可引起HK-2细胞中上皮细胞标志物E-cadherin的表达水平下降(P<0.05),表达水平不受氰酸盐浓度的影响.与此同时,Fibronectin和α-SMA的表达水平从0.5 mmol/L氰酸盐开始随负荷浓度增加而表达水平增强, Fibronectin表达水平增加在 1 mmol/L 氰酸盐浓度时具有明显差异(P<0.05),2 mmol/L氰酸盐浓度时具有显著性差异(P<0.01);α-SMA表达增加在2 mmol/L氰酸盐浓度时具有统计学差异(P<0.05).
5.细胞免疫荧光检测EMT标志物:正常组细胞中Fibronectin、α-SMA的未见荧光信号,E-cadherin红色荧光信号强烈,均匀分布于胞浆中;氰酸盐组细胞中E-cadherin红色荧光信号明显降低,而胞浆中Fibronectin、α-SMA的荧光信号显著增强.
6.Western blot检测TGF-β的水平:在1 mmol/L氰酸盐浓度时具有明显差异(P<0.05),2 mmol/L氰酸盐浓度时具有显著性差异(P<0.01).
结论
氰酸盐作用于人肾小管上皮细胞后引起细胞形态和活力的改变,伴随着ROS表达升高,多种EMT标志物以及TGF-β的表达上调,且呈浓度依赖性.以上结果提示氰酸盐触发肾小管上皮细胞的上皮-间质转化,通过TGF-β过表达从而加速肾纤维化.
血液透析病人血浆中LL-37 与抑郁状态的研究
精神疾病在慢性肾病(CKD)患者中极为常见,包括抑郁症,痴呆症,谵妄症,焦虑症,人格障碍和药物滥用,其中抑郁症是终末期肾病ESRD患者最常见的精神问题[1].抑郁症的症状分为认知和躯体症状.抑郁症的躯体症状与尿毒症的症状非常相似,如厌食症,睡眠障碍,疲劳,胃肠道疾病[1-3].这些相似之处使得对血液透析合并抑郁状态的认识变得困难.与此同时,在不同研究中,针对不同人群采用不同的评估工具,使得CKD患者的抑郁症患病率差异很大[2].一些研究报道了患病率高达30%[1-3].因此,如果能找到一种客观评价的指标,结合各种量表等评估工具,对于CKD合并抑郁状态的诊断具有重要意义.
抑郁症的病因复杂,目前尚无明确的病理生理机制,主要涉及到有以下假说,如单胺假说、下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)调节异常假说等.由于CKD本身是涉及多系统、多器官的疾病,而这类复杂疾病的机制都涉及到免疫因素.并且目前研究证明抑郁症的发生机制与免疫紊乱有密切关系[4].
LL-37是人体内唯一一种有效的抗菌肽,由免疫细胞生成释放入血.最近的研究结果强调LL-37除了杀菌作用外,调节免疫系统功能,并作为先天和适应性免疫反应之间的桥梁,因此参与各种生理和病理过程[5, 6].有研究表明它参与了自身免疫性疾病的病理生理过程[7].最近的一项研究显示LL-37水平与老年女性抑郁症状之间存在相关性[8].因此从免疫的角度去探讨透析病人抑郁发生与免疫紊乱之间的关系是具有主要价值.
目的
本文招募32位透析伴抑郁状态患者,33位透析未伴抑郁状态患者,32位健康未伴抑郁状态的志愿者.采集病史、血清、相关的临床资料,血清进行ELISA实验,并对结果统计分析,找出抑郁状态与血浆LL-37水平的相关性.
方法
在这项研究中,2013年6月至2015年12月期间,从重庆医科大学附属第二医院招募了32名伴有抑郁症状的HD患者和33名未伴抑郁症状的HD患者(HDND).同时,随机选择32名健康志愿者(HV)作为对照组.本研究采用汉密尔顿抑郁评定量表(HAMD)评估抑郁状态,为确保抑郁症状的准确性,将HD患者分为两组;评分为0-17的患者纳入非抑郁组,而评分超过17的患者则纳入抑郁组.采集血样后,离心获得血清,取上清液存于标记好的EP管中,分析前储存在-80℃冰箱.使用ELISA试剂盒评估血清中LL-37的浓度.所有检测值重复三次并进行统计分析结果,P<0.05被认为具有统计学意义.
结论
与未伴抑郁症状的HD患者相比,具有抑郁症状的HD患者的血清LL-37显着升高.调整后的多变量回归分析显示,年龄,文化程度,尿素水平和肌酐水平是抑郁症状的重要预测因素.血清LL-37水平和HAMD评分之间呈正相关(R=0.292, P=0.009).