研究背景皮肤创面是临床最常见病症之一,烧伤、创伤、手术及多种内科疾病等均可导致皮肤创面的发生。创面修复,尤其是难愈性创面的修复在临床上仍面临着许多挑战,仅在美国,每年应用于难愈性创面治疗的直接医疗费用就超过了250亿美元。近年来虽对皮肤创面修复进行了较多的研究,但其机理并未完全清楚。创面血管新生是创面修复的关键环节之一,创面血管新生主要包括血管基底膜降解、血管内皮细胞迁移与出芽生长、管腔形成、局部需要性调整与稳定成熟等步骤。整个过程涉及多种细胞与细胞因子,其中微血管内皮细胞是参与此过程的主要功能细胞,它们在多种细胞因子及信号通路的精确调控下,通过迁移、增殖、芽生等而形成新生血管。VEGF(现在表示为VEGFA)是创面愈合过程中最主要的促血管生成因子。VEGF及其介导的各级联信号通路参与血管新生各个过程。VEGFR2是VEGF最主要的结合受体,能够转导VEGF的所有已知作用,是在血管生成中发挥重要作用的VEGFR。VEGF与VEGFR2结合,在小鼠中使得VEGFR2 Tyr1173磷酸化(人类中Tyr1175磷酸化),该位点的磷酸化对ERK1/2激活至关重要,研究发现将其突变为苯丙氨酸(Tyr1173F)后,在胚胎发育时期内皮祖细胞分化受到抑制,进而导致胚胎早期死亡,这与敲除VEGFR2基因后的表现一致。P311是一种在种属间高度保守的细胞内多功能蛋白。虽然目前P311并不属于任何已知的蛋白质家族,但是现有研究发现P311蛋白在组织纤维化、神经系统疾病、肿瘤浸润、血压维持、组织再生等多方面发挥重要作用。我们课题组近期研究发现,P311在创面愈合中发挥重要作用。P311通过增强表皮干细胞Rho A和Rac1的活性提高表皮干细胞迁移能力,从而促进创面再上皮化。此外,P311可以通过TGFβ1/Smad信号通路,促进表皮干细胞向肌成纤维纤维样细胞转分化,从而促进烧伤创面的修复。鉴于创面血管新生是创面修复的关键环节之一,本课题在通过生物信息学预测发现P311可能参与血管形成的基础上,研究了P311对真皮微血管内皮细胞生物学功能的影响及其在创面血管新生的作用,并进一步从对VEGFR2/Erk1/2信号通路活化和VEGF表达调控的角度探讨了P311调控创面血管新生的分子机制。第一部分构建P311蛋白质相互作用网络初步探索其生物学功能方法:1.生物信息学预测P311功能将前期通过酵母双杂交实验鉴定出的能够与P311相互作用的蛋白,与P311一起构成原始P311蛋白质相互作用网络,进一步将此网络与已知的人类蛋白质相互作用网络分别合并,形成新的蛋白相互作用数据集。通过OCG算法处理该数据集,得到重构的P311蛋白质相互作用网络。通过DAVID分析各组重构P311蛋白质相互作用网络中的蛋白参与的生物过程,以预测P311可能的功能。2.P311在创面愈合过程中炎症反应中的作用使用P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠分别构建全层皮损模型,通过HE染色观察创面浸润炎症细胞;实时定量PCR检测创面CD14和CD16 mRNA水平;流式细胞仪检测创面中F4/80阳性炎症细胞的百分比。3.P311对小鼠成纤维细胞的增殖的影响使用P311重组腺病毒载体转染小鼠成纤维细胞,使之高表达P311。通过CCK8检测P311对成纤维细胞增殖能力的影响;通过流式细胞仪检测P311对细胞周期的影响。4.P311对烧伤后凝血功能的影响使用P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠分别构建浅Ⅱ°烧伤模型,使用血栓弹性描记图监测烧伤后血液的凝血特征。结果:1.生物信息学预测P311功能P311可能拥有14种新功能,其中P311在血管形成、炎症反应、细胞增殖和凝血中发挥作用最可信。2.P311在创面愈合过程中炎症反应中的作用HE染色发现,P311基因敲除小鼠创面炎症细胞和F4/80阳性细胞的数目明显低于P311野生型小鼠。P311基因敲除小鼠创面内CD14和CD16 mRNA水平明显低于P311野生型小鼠。3.P311对小鼠成纤维细胞的增殖的影响P311促进小鼠成纤维细胞的增殖。高表达P311的成纤维细胞中处于S期细胞比例明显较对照组比例高(25.16±4.92%vs 36.68±3.56%,p<0.05)。4.P311对烧伤后凝血功能的影响比较P311 WT烧伤小鼠与P311 KO烧伤小鼠血液血栓弹性描记图,除血凝块形成时间(R 8.850±1.541vs 7.733±1.210min,p=0.57)外,角度、MA和G等参数均有显著差异(p<0.05)。综上所述,我们通过构建P311蛋白质相互作用网络的生物信息学方法,预测了P311可能拥有14种新功能,其中P311在血管形成、炎症反应、细胞增殖和凝血中发挥作用最可信。并通过生物学实验初步证实P311参与炎症反应、细胞增殖和凝血过程。P311在血管形成中的作用在第二三部分进行系统研究。第二部分P311在创面血管新生中的作用方法:1.真皮微血管内皮细胞表达P311,在炎症刺激条件下其表达增强免疫组化和免疫荧光染色观察人创面和小鼠创面P311的表达情况;采用Percoll分离+CD31磁珠分离法分离培养小鼠真皮微血管内皮细胞,荧光和流式检测了分离细胞血管内皮细胞标志物的表达。免疫荧光染色和实时定量PCR检测分离培养的微血管内皮细胞在稳定状态和炎症刺激状态(IL-1β刺激)下P311的表达情况。2.P311对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响利用细胞体外划痕迁移模型检测了P311敲除后对真皮微血管内皮细胞迁移功能的影响;利用体外基质胶血管管腔形成实验检测P311敲除后对真皮微血管内皮细胞体外血管形成的影响;利用体内皮下基质胶栓实验检测P311敲除后对真皮微血管内皮细胞体内血管形成的影响。3.P311在小鼠创面血管新生的作用使用P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠分别构建全层皮损模型,大体和HE染色观察P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠的创面愈合、再上皮化和新生肉芽及微血管形成的规律;免疫组化染色观察小鼠创面、正常皮肤中CD31、VEGF和TGFβ1的表达情况;Western Blot检测小鼠创面、正常皮肤中CD31、VEGF和TGFβ1的表达情况;ELISA检测小鼠创面、正常皮肤中VEGF和TGFβ1的表达情况。结果:1.真皮微血管内皮细胞表达P311,在炎症刺激条件下其表达增强1.1创面微血管内皮细胞表达P311免疫组化观察到在人皮肤创面血管样结构中出现一些P311阳性细胞,进一步通过免疫荧光在小鼠创面中观察到在肉芽组织中vWF阳性细胞也表达P311,即血管内皮细胞表达P311。1.2成功分离培养真皮微血管内皮细胞分离培养的细胞融合后呈特征性“鹅卵石”形态,并且高表达vWF、CD31和CD34。1.3真皮微血管内皮细胞表达P311免疫荧光结果显示小鼠真皮微血管内皮细胞表达P311,但表达量不高,10ng/ml IL1β刺激后表达明显增强。定量PCR结果显示,10ng/ml IL1β刺激后小鼠真皮微血管内皮细胞中P311转录水平明显提高(p<0.01)。2.P311敲除对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响2.1 P311敲除减弱真皮微血管内皮细胞体外血管管腔形成能力体外基质胶血管管腔形成实验结果显示,P311敲除后真皮微血管内皮细胞形成的管状结构中的节点数明显减少(p<0.01),管状结构总长度明显变短(p<0.01)。2.2 P311敲除减弱真皮微血管内皮细胞体外迁移能力细胞体外划痕迁移实验结果显示,P311敲除后,各观察时间点真皮微血管内皮细胞覆盖区域均明显减少(p<0.01)。2.3 P311敲除减弱真皮微血管内皮细胞体内血管形成能力体内皮下基质胶栓实验结果显示,P311敲除后基质胶栓中内皮细胞数量明显减少p<0.01)。3.P311在小鼠创面血管新生的作用3.1 P311敲除小鼠创面愈合、再上皮化减慢大体观察发现伤后第3天、第5天和第7天P311WT小鼠创面面积百分比均明显小于P311KO小鼠创面面积百分比。P311 WT小鼠创面平均6.2天愈合而P311 KO小鼠的创面平均7.8天愈合(p<0.05)。HE染色发现,伤后第3天和第5天,P311KO小鼠创面新生上皮长度显著短于P311WT小鼠创面新生上皮长度(p<0.05)。3.2 P311敲除小鼠创面新生肉芽及微血管减少HE染色发现,P311KO小鼠创面新生肉芽组织厚度较P311WT小鼠创面新生肉芽组织厚度薄,且P311KO小鼠创面新生肉芽组织中可见的微血管数量较P311WT小鼠创面新生肉芽组织中可见的微血管数量少(p<0.05)。免疫组化染色发现,P311 KO创面小鼠创面新血管数量(CD31阳性细胞)显著低于P311 WT创面小鼠;Western Blot分析结果显示P311WT小鼠创面组织中CD31蛋白水平明显较P311KO小鼠创面CD31蛋白水平高(P<0.01)。3.3 P311敲除小鼠创面VEGF和TGFβ1的表达减少免疫组化染色发现P311 KO创面小鼠创面VEGF和TGFβ1表达均明显低于P311WT创面小鼠;Western Blot结果显示P311WT小鼠创面组织中VEGF和TGFβ1蛋白水平均明显较P311KO小鼠创面VEGF和TGFβ1蛋白水平高(P<0.01);ELISA结果显示P311 KO创面组织匀浆上清液中VEGF和TGFβ1的浓度明显低于P311 WT创面。综上所述,我们首次报道了P311通过影响真皮微血管内皮细胞的生物学功能来影响创面愈合中的血管新生。第三部分P311促进创面血管新生的机制研究方法:1.P311高表达对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响利用细胞体外划痕迁移模型检测P311高表达对真皮微血管内皮细胞迁移功能的影响;利用体外基质胶血管管腔形成实验检测P311高表达对真皮微血管内皮细胞体外血管形成的影响;nCounter基因表达谱分析系统和实时定量PCR检测P311高表达对真皮微血管内皮细胞血管生成基因表达的影响。2.P311通过VEGFR2/ERK1/2信号通路促进血管形成利用Western blot检测P311高表达对VEGFR2和ERK1/2蛋白表达和磷酸化水平的影响;使用siRNA-VEGFR2和ERK1/2抑制剂SCH772984,利用Western blot和体外基质胶血管形成实验,检测P311通过激活VEGFR2进而激活Erk1/2,从而促进血管形成。3.P311对VEGF表达的调控使用P311重组腺病毒载体转染真皮微血管内皮细胞,使之高表达P311,通过Western Blot和实时定量PCR检测VEGF在微血管内皮细胞内的表达情况,通过ELISA检测VEGF在微血管内皮细胞培养上清中的水平。4.P311调控VEGF表达的分子机制构建VEGF启动子双荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告实验检测P311对VEGF启动子活性的影响;通过亚硫酸氢盐测序法检测P311对VEGF启动子CpG岛甲基化的影响;通过放线菌素D处理符合实时定量PCR检测P311对VEGF mRNA稳定性的影响;构建VEGF非翻译区(Untranslated region,UTR)双荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告实验检测P311对VEGF UTR活性的影响。结果:1.P311高表达对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响1.1 P311高表达提高真皮微血管内皮细胞体外血管管腔形成能力体外基质胶血管管腔形成实验结果显示,P311高表达后真皮微血管内皮细胞形成的管状结构中的节点数明显增多(p<0.01),管状结构总长度明显变长(p<0.01)。1.2 P311高表达提高真皮微血管内皮细胞体外迁移能力体外细胞划痕迁移实验结果显示,P311高表达后,各观察时间点真皮微血管内皮细胞覆盖区域均明显增多(p<0.01)。1.3 P311高表达上调真皮微血管内皮细胞促血管生成基因的表达实时定量PCR结果显示,真皮微血管内皮细胞高表达P311后,CCL2表达上调3.66倍(p<0.05),CXCL8表达上调4.58(p<0.05),FGFR3表达上调2.36(p<0.05),IL6表达上调2.55(p<0.05),PTGS1表达上调29.58(p<0.05),VEGF表达上调2.94(p<0.05)。2.P311通过VEGFR2/ERK1/2信号通路促进血管形成2.1 P311高表达促进VEGFR2和ERK1/2磷酸化P311高表达后,真皮微血管内皮细胞VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平分别提高到对照组水平的3.62倍和2.17倍。2.2 siRNA-VEGFR2抑制VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平,阻断P311对血管形成的促进作用使用siRNA-VEGFR2后,微血管内皮细胞VEGFR2的磷酸化水平和总蛋白表达明显降低(p<0.05),Erk1/2的磷酸化水平明显降低(p<0.05),P311对血管形成的促进作用明显受到抑制(p<0.05)。2.3 SCH772984抑制Erk1/2的磷酸化,阻断P311对血管形成的促进作用使用SCH772984后,微血管内皮细胞Erk1/2的磷酸化水平明显降低(p<0.05),P311对血管形成的促进作用明显受到抑制(p<0.05)。3.P311对VEGF表达的调控实时定量PCR结果显示,P311高表达后,微血管内皮细胞内VEGF mRNA水平显著升高(p<0.05);Western Blot结果显示,P311高表达后,微血管内皮细胞内VEGF蛋白质水平显著升高(p<0.01);ELISA结果显示,P311高表达后,微血管内皮细胞培养上清中VEGF含量显著升高(p<0.01)。4.P311调控VEGF表达的分子机制4.1 P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合,从而提高启动子活性,促进VEGF的转录双荧光素酶报告实验结果显示,P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合。亚硫酸氢盐测序结果显示P311对VEGF启动子CpG岛甲基化无影响。4.2 P311通过与VEGF mRNA 3’-UTR和5’-UTR结合并提高其活性,进而诱导VEGF蛋白的翻译实时定量PCR结果显示,P311高表达对VEGF mRNA的稳定性没有影响;双荧光素酶报告实验结果显示,P311与VEGF mRNA 3’-UTR和5’-UTR结合并提高其活性,进而诱导VEGF蛋白的翻译综上所述,P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合,从而提高启动子活性,进而促进VEGF的转录,同时P311通过与VEGF mRNA 5’-UTR和3’-UTR结合并提高其活性,促进VEGF翻译,从而促进VEGF的表达和分泌,进而激活VEGFR2/Erk1/2通路,促进血管新生。结论本研究首次证明P311是一种新的促进创面血管新生的关键分子,P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合,提高启动子活性,促进VEGF的转录;P311通过与VEGF mRNA 5’-UTR和3’-UTR结合并提高其活性,促进VEGF的翻译,从而促进VEGF的表达和分泌,进而激活VEGFR2/Erk1/2信号通路促进血管形成。