人纤溶酶原（plasminogen）含有5个环状结构域（kringles），水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin（kringles1—4），kringles1—5，kringles1—3和kringles5（K5），具有抑制内皮细胞增生的作用。血管抑素（Angiostatin）用于肿瘤的治疗已进入临床Ⅰ期试验阶段。较之血管抑素（分子量约45KDa），K5具有分子量小（16KDa）、性质稳定且活性更强的优点。 在肿瘤组织中由于肿瘤细胞快速生长，造成局部微环境相对缺氧。HIF—1a是细胞在低氧状态下被活化的最重要的核转录因子和细胞内氧适应调节因子，它能和靶基因启动子中缺氧反应元件（HRE）结合调控靶基因如血管内皮生长因子（VEGF）、红细胞生成素（EPO）等的表达，在介导缺氧微环境促进恶性实体瘤生长和转移中起关键作用。 血管内皮生长因子（VEGF）是一种很强的血管增生刺激因子，几乎所有的实体瘤细胞都能分泌。肿瘤细胞分泌的VEGF可诱导或调控肿瘤的血管形成及新生血管的结构和功能异常，从而支持肿瘤生长。一方面以旁分泌的方式作用于血管内皮细胞与血管内皮细胞上的受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化和血管生成；另一方面，以自分泌的方式与肿瘤细胞上的Flt—1或KDR受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。目前对K5的研究大多数集中在其对内皮细胞的作用，而对肿瘤细胞直接作用的研究甚少。以往研究证实在微血管内皮细胞K5能通过下调核内HIF—1a而抑制VEGF表达，具体机制未见深入研究。K5能否通过对肿瘤细胞HIF—1a信号调控途径的抑制而在肿瘤生长的防治中发挥潜在的抗瘤活性，尚未有系统研究。 综上所述，本课题拟从K5抑制胃癌生长进行深入研究：（1）表达纯化K5（2）在细胞水平和肿瘤模型上证明K5对肿瘤生长的抑制作用。（3）以SGC7901胃癌细胞为研究对象，从HIF—1a调控VEGF细胞信号通路为切入点，探索K5对核转录因子HIF—1a及VEGF的作用，揭示K5抑制肿瘤生长的分子机制。 主要研究内容和结果如下： 第1部分K5表达及纯化 1．获得高纯度可溶性的重组蛋白。鉴定正确的重组体转化到BL21（DE3）宿主菌中，经IPTG低温诱导，可表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用Ni2+—His Bind Resin亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。用凝胶成像系统（GENE GENIUS公司产品）对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达：K5约为92．6%，纯化的重组蛋白经Western—blot分析显有明显的免疫杂交带。 第2部分K5蛋白抑制胃癌生长的体内外研究 1．K5对培养的SGC—7901细胞增殖的影响。K5无明显地抑制SGC—7901细胞增殖的作用。 2． K5抑制胃癌裸鼠肿瘤生长的效应。腹腔注射K5总剂量为12．5mg/kg时，对BALB/c裸鼠胃癌（SGC—7901）实体瘤生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为67%。 第3部分K5抑制胃癌生长的分子机制初步探讨 1．K5对HIF—1a具有下调作用，并抑制其核转位。通过SP免疫细胞化学法和Western—blot分析，结果显示K5在低氧下对SGC—7901胃癌细胞具有下调HIF—1a并抑制其核转位，而在常氧下无明显的作用。 2． K5下调SGC—7901胃癌细胞VEGF的表达。通过SP免疫细胞化学法和Western—blot分析，显示K5在低氧下对SGC—7901胃癌细胞VEGF的表达具有下调作用，并呈剂量依赖性；在常氧下变化不明显。 结论及研究意义: 1．获得其基因工程纯化蛋白。 2．首次发现K5具有抑制胃癌生长的作用。 3．首次在SGC—7901胃癌细胞异种种植裸鼠模型上，阐述了K5抑制肿瘤新生血管从而抑制肿瘤生长的机制：K5通过下调HIF—1a和抑制其核转位来降低VEGF的表达。在SGC—7901胃癌细胞肿瘤上，肿瘤细胞分泌的VEGF通过旁分泌作用于肿瘤血管内皮细胞，影响肿瘤血管增生从而抑制肿瘤生长。该研究拓宽了K5的治疗范围，不仅可用于血管增生性疾病的治疗，同时也是胃癌等恶性肿瘤治疗的新的有效候选药物。