[背景]肝移植作为治疗终末期肝病的唯一有效手段,已被广泛接受。虽然经过多年的发展,目前围手术期死亡率已下降到5%左右,10年生存率更达到了80%,但是供肝离体后造成的缺血再灌注损伤仍然是需要解决的问题之一。研究发现,移植肝缺血再灌注损伤是导致肝脏原发性无功能的主要原因之一。近些年来人们开始寻找有效减轻缺血再灌注损伤的手段,但是仍没有彻底解决这一问题。有学者首先在肝切除中提出了阻断门静脉的缺血预处理措施,减少缺血再灌注损伤。此后又有学者在心肌缺血再灌注损伤的研究中提出了缺血后处理的方法以减轻心肌的损伤。随着分子生物学的发展,改良或者重组体内目的基因去减轻缺血再灌注损伤的方法也被逐渐使用。如白介素-1,白介素-13,血红氧合素酶-1等基因在体内的重组表达。近年来有着“移植保护基因”之称的血红氧合素酶-1(HO-1),成为了研究的热点。它是血红素代谢的限速酶,在哺乳动物体内表达量可观并且分布广泛,有高度的可诱导性,在肝脏中其通过抑制枯否细胞分泌炎症介质等作用减轻肝脏损伤。在以往的研究中已发现HO-1能够减轻移植肝的缺血再灌注损伤,并且发现HO-1能够改善移植肝胆道的微循环,但其对胆道周围微循环,特别是胆道周围毛细血管丛的作用及具体方式仍不清楚。[目的]本研究根据HO-1对移植肝缺血再灌注损伤的保护作用和胆管缺血再灌注损伤的特点,使用改良“二袖套”法建立大鼠肝移植模型,构建HO-1过表达和HO-1 RNAi腺病毒并转染大鼠,重组体内HO-1基因,探讨移植肝缺血再灌注损伤后,HO-1对移植肝胆道周围血管丛再生的作用方式和机制。[方法]1.实验分组：将160只雄性SD大鼠随机分入以下5组,供体诱导组(Induce/Suppress, I/S供体转染HO-1过表达腺病毒,受体转染HO-1基因RNAi腺病毒)；供、受体诱导组(I/I,供、受体均转染HO-1过表达腺病毒)；受体诱导组(S/I,供体转染HO-1基因RNAi腺病毒,受体转染HO-1过表达腺病毒)；供、受体抑制组(S/S,供、受体均转染HO-1基因RNAi腺病毒)；空病毒组(Control,C供、受体均转染空病毒)。2.腺病毒转染效率检测：选取相同大鼠,注射诱导或者抑制HO-1基因的腺病毒,使用Western blot检测其体内转染效率。3.模型建立：选取200-220g成年大鼠,应用改良式“二袖套”法建立大鼠肝移植模型。4.血清学检测：分别于肝移植术后1d,3d,7d,14d取血使用全自动生化分析仪检测肝功能(ALT,AST,ALP,GGT), ELISA法检测术后各时间血清肝细胞生长因子(HGF)。5.光镜和电镜观察肝脏组织形态学改变,并对肝脏组织病理切片进行Suzuki评分。6.Western-blot检测：肝脏组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、血红素氧合酶-1(HO-1)表达量的检测。7.激光共聚焦显微镜观察角蛋白18(CK-18)和层粘蛋白(LN)双重免疫荧光,血管性血友病因子(vWF)免疫荧光并计数其中血管数量。8.统计学分析：使用SPSS17.0进行统计学分析,多组计量资料的比较使用单因素方差分析,进一步两两比较使用LSD检验；多组计数资料的比较使用R×C卡方检验。计量资料使用x±s表示。p<0.05认为差异有统计学意义。[结果]1.血清学检测：肝功能检测,术后7d、14d时,I/S组和I/I组AST、ALT、 ALP、GGT低于S/I组、S/S组和空病毒组,且空病毒组AST和ALT低于S/I组和S/S组,差异均具有统计学意义(p<0.05)。ELISA检测HGF,术后7d,I/S组HGF (229.43±77.05)pg/ml, I/I组为(248.57±68.48)pg/ml高于S/I组(131.29±24.40)pg/ml和S/S组(109.12±26.92)pg/ml,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.病理组织切片结果：在病理组织形态上I/S组、I/I组与S/I组、S/S组相比,肝细胞水肿程度较轻,炎症细胞浸润较少,汇管区结构正常。I/S组和I/I组的Suzuki评分低于S/I组、S/S组和空病毒组,且空病毒组Suzuki评分低于S/I组和S/S组,差异均具有统计学意义(p<0.05)。3.透射电镜结果：I/S组与I/I组胆管上皮细胞结构基本正常,胆管内有微绒毛结构。然而S/I组和S/S组胆管上皮细胞内可见大小不等的溶酶体,扩张的滑面内质网和高尔基体。4.Western blot检测：术后1d,HO-1与VEGF (24KD) I/S组与I/I组表达水平高于S/I组、S/S组和空病毒组,差异具有统计学意义(p<0.05),S/I组、S/S组和空病毒组,差异无统计学意义(p>0.05)。术后7d, HO-1, HIF-la, VEGF(43KD), VEGF(24KD)I/S组与I/I组表达水平高于S/I组、S/S组和空病毒组,S/I组和S/S组HO-1, HIF-la水平低于空病毒组,差异均具有统计学意义(p<0.05)。5.免疫荧光结果：I/S组、I/I组与S/I组、S/S组比较,细胞内支架结构恢复更好,肝内胆道与血管结构较好,且新生小血管数量较多。I/S组和I/I组的血管数量明显多于S/I组、S/S组和空病毒组,差异具有统计学意义(p<0.05)。[结论]1.改良式“二袖套”法大鼠肝移植模型保证了大鼠的存活率,是一种稳定性和可操作性强并且更符合临床肝移植病理生理过程的模型。2.HO-1的过表达能够有效的减轻肝细胞水肿和炎症细胞浸润,加快肝病功能恢复,缓解肝脏缺血再灌注损伤；反之,抑制HO-1表达,不利于移植肝从缺血再灌注损伤中恢复。3.HO-1的过表达能通过诱导HIF-1α和VEGF表达,增加肝内血管再生,促进胆道结构和功能的恢复,减轻移植肝胆道缺血再灌注损伤。4.在肝移植缺血再灌注损伤中,HO-1基因可能在供肝内发挥主要作用。