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背景血清中脂质的水平,尤其是氧化型低密度脂蛋白的水平与白内障的发生有关,但是氧化型低密度脂蛋白在白内障发展中的作用机制尚不清楚。已有众多文献支持晶状体内钙(Ca2+)超载与晶状体的混浊程度密切相关。钙库操控的钙内流(SOCE)是介导晶状体囊膜上皮细胞Ca2+流入的重要途径。Orai家族蛋白(形成SOCE通道)位于细胞膜上,以响应内质网中Ca2+库储存的耗尽,控制细胞外Ca2+的流入。在我们的研究中,我们在含有氧化型低密度脂蛋白的培养基中培养人的晶状体囊膜上皮细胞(HLEpiCs)以模拟体外高脂肪环境,探究氧化型低密度脂蛋白对HLEpiCs细胞的增殖和钙信号的影响机制。本研究为肥胖症或高脂血症合并白内障的发生机制提供新见解。目的1.探究氧化型低密度脂蛋白对HLEpiCs细胞增殖的影响机制;2.探究氧化型低密度脂蛋白对HLEpiCs细胞钙信号的影响机制。方法1.RNA的提取、测序和分析分别提取经过氧化型低密度脂蛋白和对照处理的HLEpiCs细胞的RNA,利用Illumina平台对RNA样本进行测序并获得原始数据。将通过质量检测的数据进行差异分析、聚类分析。2.免疫蛋白印迹实验Western Blot检测经过氧化型低密度脂蛋白和对照处理的HLEpiCs细胞Orail、Orai2和Orai3蛋白表达水平。3.细胞增殖实验将不同处理因素的HLEpiCs细胞接种于96孔板(103-104个/每孔),每孔100 μ L培养基,培养24h。然后每孔加入10μL CCK-8溶液,继续在培养箱内孵育2h左右。将细胞培养板放入酶标仪中,检测各组HLEpiCs细胞在450nm波长时的吸光值。4.Ca2+成像实验将不同处理因素的HLEpiCs细胞接种在盖玻片上,培养24h。然后加入荧光染料(Fluo-8)孵育 30min,分别加入三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)和氯化钙(CaCl2)检测Ca2+释放和钙库操控的钙内流。5.基因敲除鼠的鉴定首先从大鼠脚趾组织提取DNA,利用PCR扩增技术扩增大鼠DNA。根据琼脂糖凝胶电泳测定结果鉴定敲除鼠。6.统计学分析所有数据以平均数±标准误(mean ± S.E.M.)表示。两组之间的差异使用非配对的t检验(Student’s unpaired t test)分析,当P<0.05时认为两组之间差异具有统计学的意义。结果(1)聚类分析结果显示,氧化型低密度脂蛋白增强了 HLEpiCs细胞Orai3的表达,但未显著改变Orail或Orai2的表达。(2)氧化型低密度脂蛋白促进了 HLEpiCs细胞的增殖,并且呈浓度依赖性。(3)氧化型低密度脂蛋白显著增加HLEpiCs细胞ATP诱导的SOCE,但对Ca2+释放无显著影响。(4)免疫蛋白印迹实验结果显示,氧化型低密度脂蛋白增强了 HLEpiCs细胞Orai3的表达,但未显著改变Orail或Orai2的表达。(5)Orai3的下调显著降低了 HLEpiCs细胞的增殖能力和ATP诱导的SOCE。结论(1)氧化型低密度脂蛋白增强了 HLEpiCs细胞Orai3的表达,但未显著改变Orail或Orai2的表达。(2)氧化型低密度脂蛋白促进了 HLEpiCs细胞的增殖,并且Orai3 siRNA抑制了氧化型低密度脂蛋白引起的增殖增强。(3)氧化型低密度脂蛋白增加HLEpiCs细胞ATP诱导的SOCE,并且Orai3 siRNA抑制了氧化型低密度脂蛋白引起的SOCE水平升高。