肠炎沙门菌是一种对人类和动物都有高致病性的沙门菌血清型,与人类感染关系密切,是重要的食源性病原菌和人畜共患菌。食入被污染的肉制品(主要是禽类)及蛋制品是人类肠炎沙门菌病爆发的主要危险因素之一。肠炎沙门菌感染人类主要表现为以小肠结肠炎为代表的胃肠道疾病。通常,这类感染具有自身限制性并且在3-5天内被清除。肠炎沙门菌感染两周龄以内的禽类则表现出明显的临床症状和高水平的死亡率,同时肠炎沙门菌能侵袭产蛋母鸡造成全身性感染并传递给子代。目前,对肠炎沙门菌致病机制的研究虽然有一定的进展,但仍处于初级阶段。因此,寻求肠炎沙门菌潜在的致病基因对于了解其致病机理及有效地防治肠炎沙门菌病都具有重要的意义。本研究运用SCOTS (selective captured of transcribed sequences)筛选和鉴定了肠炎沙门菌在感染禽源和鼠源巨噬细胞过程中肠炎沙门菌的转录序列,为全面认识肠炎沙门菌的致病机理提供了基础。1.选择性捕获肠炎沙门菌在不同源巨噬细胞内的转录序列选取鼠源巨噬细胞RAW264.7和禽源巨噬细胞HD-11作为细胞模型,比较并分析了肠炎沙门菌C50041菌株对两种细胞的侵染能力及胞内的增殖变化趋势。结果显示：肠炎沙门菌对禽源巨噬细胞的侵染率高于鼠源巨噬细胞,且肠炎沙门菌在两种不同源巨噬细胞内的增殖趋势存在明显的差异。在此基础上,利用选择性捕获转录序列技术(SCOTS)筛选细菌感染巨噬细胞2hr时的表达序列,通过cDNA序列同源性比对分析蛋白的功能。结果显示：在侵染禽源巨噬细胞和鼠源巨噬细胞过程中分别筛选获得了58个和54个转录序列。其中包括毒力基因、代谢相关基因、环境适应性相关基因、分子合成和降解相关基因、调控基因、转运蛋白编码基因和功能未知基因。研究显示肠炎沙门菌在感染不同源巨噬细胞过程中,除个别表达序列相同,多数表达序列存在明显差异,为揭示肠炎沙门菌对不同宿主的致病机制提供了理论基础和依据。2.实时荧光定量PCR检测SCOTS筛选序列在细菌感染过程中的表达情况本研究采用SYBR(?)Green实时定量PCR方法,通过相对定量分析(2-ΔΔCT)来比较肠炎沙门菌感染巨噬细胞2hr和在胞内增殖5hr时,肠炎沙门菌在细胞内mRNA转录水平与体外的差异。根据SCOTS筛选结果,我们随机从肠炎沙门菌感染HD-11中筛选所得的58个序列中随机选取12个基因(invJ、ycaM、bigA、SEN4299、SEN3610、SEN0988、nlpB, SEN2555、SEN0815、SEN2967、stdB和yiaG),从肠炎沙门菌感染RAW264.7中筛选所得的54个序列中选取12个基因(dnaG、cbiK、rbfA、copS、rseB、rtcR、rfaQ、secG、 flgK, lpfC和phoB),检测其在HD-11和RAW264.7中的表达情况。结果显示,所有基因在两种巨噬细胞中都得到了表达,证明了SCOTS技术的可靠性。同时,检测结果发现,除个别基因在胞内表达水平与体外培养过程中不存在差异,多数基因在感染细胞过程中表达明显上调。其中,细菌侵染HD-11过程中筛选的基因在感染HD-112hr时的表达量均低于增殖5hr的量,而在RAW264.7中,各基因仍表达,且表达量与在HD-11中无显著差异。而细菌侵染RAW264.7过程中筛选的基因在感染RAW264.72hr时的表达量与增殖5hr时无显著差异,但在HD-11中,各基因的表达量显著下调,尤其是在增殖5hr点,其表达量下降水平明显。此外,部分基因在细菌感染细胞的过程中上调表达水平达到20倍以上,有的甚至达到100倍,对于这些基因的深入研究及细菌在感染两种细胞过程中表达差异明显的基因研究将有助于进一步揭示肠炎沙门菌在感染不同宿主过程中的致病机制差异。