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研究背景过氧化物酶体增殖物激活受体a(Peroxisome Proliferator-activated Receptora, PPARa)是一类由配体激活的核转录因子,属于细胞核受体超家族,其功能是作为转录因子调节许多基因的表达。PPAR家族在细胞分化、发育和代谢方面具有重要作用并且在脂肪酸的摄取和氧化中起到转录调控作用。PPARy转录辅助因子1(PGC-1)家族基因PGC-1α和PGC-1β与线粒体生物合成和体内能量代谢密切相关。PPARa激动剂非诺贝特(Fenofibrate)是临床治疗用于降血脂的药物,可以治疗高血脂或Ⅱ型糖尿病所引起的脂质代谢紊乱。其作用机理是通过抑制极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的生产同时加速其分解代谢,从而降低极低密度脂蛋白、胆固醇和甘油三酯含量,为了进一步了解其在代谢方面的作用,我们研究了PPARa激动剂非诺贝特对小鼠心室细胞线粒体功能相关基因表达的影响。首先非诺贝特处理小鼠,然后提取心室RNA并检测核呼吸因子,线粒体外膜蛋白40,硫辛酸合成酶,细胞色素b,中链脂酰辅酶A脱氢酶和过氧化物酶体增殖物激活受体共活化物的mRNA表达水平,同时分析非诺贝特对小鼠心室脂肪含量的影响,上述研究探讨了非诺贝特对小鼠心脏能量代谢的作用。贝特类药物还可增强机体对于胰岛素的敏感性,在缓解糖尿病以及由此引发的心血管疾病方面有重要作用。本课题组在研究非诺贝特受体PPARa对葡萄糖代谢的调节机制中发现：在胰岛素刺激下,PPARa及其相互作用蛋白-转录因子GATA6都促进葡萄糖消耗和提高柠檬酸合酶活性,但同时100nM的胰岛素又促进细胞凋亡。为了进一步探讨非诺贝特-PPARa-GATA6-胰岛素-能量代谢-细胞增殖与凋亡之间的联系,我们以能诱导分化为心肌细胞的小鼠畸胎瘤细胞P19CL6为靶细胞,构建稳定表达PPARa和GATA6的细胞系,研究不同浓度胰岛素对P19CL6细胞及PPARa和GATA6稳转细胞系增殖和凋亡的影响,探讨不同浓度胰岛素对P19CL6细胞影响的作用机制并研究其与细胞代谢之间的关系。目的本实验旨在研究PPARa激动剂非诺贝特对小鼠心室细胞线粒体功能有关的基因表达的影响。检测非诺贝特处理后,核呼吸因子,线粒体外膜蛋白40,硫辛酸合成酶,细胞色素b,中链脂酰辅酶A脱氢酶和过氧化物酶体增殖物激活受体共活化物的mRNA表达水平。并观察非诺贝特对小鼠心室脂肪含量的影响,探讨非诺贝特与小鼠心脏能量代谢的关系。此外,我们还探讨了另一种与非诺贝特作用机制密切相关的药物胰岛素对P19CL6细胞的作用,旨在研究胰岛素对P19CL6细胞的作用机制及与细胞代谢之间的关系。方法1.8周龄昆明种小鼠,随机分为3组：组1,对照组；组2,非诺贝特处理7天组；组3,非诺贝特处理14天组。每组包含6-8只小鼠。非诺贝特组给予非诺贝特(1OOmg/kg/day)灌胃7天或14天。对照组给予羧甲基纤维素钠混悬液灌胃14天。7天或14天以后,处死小鼠,提取心室组织RNA,经过反转录后,Q-PCR方法检测小鼠心室中NRF-1, Tom40, Lias, cytochrome b, MCAD和PGC-1α这些基因的mRNA表达情况。另一批同样处理的小鼠,采用改良的Bligh&Dyer方法提取心室中脂肪,并用甘油三酯定量试剂盒测定其含量。2.将重组质粒转染入细胞并经过G418筛选后,得到稳定表达PPARa和Gata6的细胞系。3.胰岛素对P19CL6正常细胞及稳转细胞的增殖和凋亡研究：正常细胞及稳转细胞经过不同浓度的胰岛素处理。胰岛素的浓度分别为：0、10、50、100nmo1/L。处理时间为24h,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度胰岛素对细胞增殖的影响。DAPI染色检测不同浓度胰岛素处理后细胞形态学改变。流式细胞术PI单染检测胰岛素处理后对细胞周期的影响。结果1.非诺贝特处理7天后,小鼠心室中NRF-l-L和NRF-1-SmRNA水平与对照组相比都有所下降,其中NRF-l-L mRNA下降22%,与对照组相比具有统计学意义(p<0.05)。非诺贝特处理14天后,NRF-1-LmRNA水平下降160%,同时,NRF-l-S mRN A水平上升15%。2.非诺贝特处理7天或者14天后,小鼠心室中Lias mRNA水平与对照组相比无明显差异。非诺贝特处理7天后,Tom40mRNA水平与对照组相比无明显差异；非诺贝特处理14天后,Tom40mRNA水平与对照组相比增加15%。3.非诺贝特处理7天或者14天后,小鼠心室中cytochrome b和MCADmRNA水平都有所增加。非诺贝特处理14天后,cytochrome b和MCAD mRNA水平分别增加31%和32%,与对照组相比具有统计学意义(p<0.05)。4.非诺贝特处理7天后,PGC-la mRNA水平与对照组相比无明显差异。非诺贝特处理14天后,PGC-la mRNA水平下降31%,与对照组相比具有统计学意义(p<0.05)。5.非诺贝特处理7天后,小鼠心室中脂肪含量无明显改变,非诺贝特处理14天后,其脂肪含量与对照组相比显著增加。6.MTT结果显示：低浓度胰岛素对P19CL6细胞增殖有显著促进作用(P<0.05),中浓度胰岛素对P19CL6细胞增殖无显著作用,高浓度胰岛素对P19CL6细胞增殖有显著抑制作用(P<0.01)。同样,低浓度胰岛素对PPARa和GATA6稳转P19CL6细胞增殖有显著促进作用(P<0.05),中浓度胰岛素对PPARa和GATA6稳转P19CL6细胞增殖无显著作用,高浓度胰岛素对PPARa和GATA6稳转P19CL6细胞增殖有显著抑制作用(P<0.01)。7. DAPI染色结果显示：control组的P19CL6细胞,细胞核呈现出均匀弥散荧光,细胞核周边光滑,完整；10nM组与对照组相比,细胞核形态无明显改变；50nM组与对照组相比,细胞数量减少,但细胞核形态无明显改变；100nnM组与对照组相比,细胞数量明显减少,且出现凋亡核,表现为核固缩,核碎裂和凋亡小体。PPARa和GATA6稳转P19CL6细胞形态也是如此。8.流式细胞术检测结果显示：低浓度胰岛素处理下的P19CL6细胞,G1期细胞数量显著低于对照组(P<0.05),S期细胞数量显著高于对照组(P<0.05)。GATA6和PPARa稳转P19CL6细胞用低浓度胰岛素处理后,S期细胞数量与对照组相比显著升高(P<0.05)。中浓度和高浓度胰岛素处理下的P19CL6细胞及PPARa和GATA6稳转P19CL6细胞,S期细胞数量与对照组相比显著升高(P<0.05)。结论1.非诺贝特处理小鼠14天可以显著抑制PGC-la mRNA表达,同时显著提高心肌脂肪含量。2.低浓度胰岛素能显著促进P19CL6细胞及PPARa和GATA6稳转P19CL6细胞的增殖,但是高浓度胰岛素能显著抑制P19CL6细胞及PPARa和GATA6稳转P19CL6细胞的增殖。