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甘草作为我国最常用的大宗药材之一,具备补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药等多种功效。《中国药典》自2010版明确规定:按干燥品计算,甘草样品中甘草苷(C21H22O9)的含量不得少于0.50%。目前,栽培甘草广泛存在品质退化及甘草苷含量低等问题,难以达到药典规定的最低标准。查尔酮合酶（Chalcone synthase,CHS）作为甘草苷生物合成途径中的第一个关键酶和限速酶,对于调控甘草中黄酮类化合物的生物合成具有重要作用。研究功能基因CHS的多态性及其对黄酮类化合物积累的作用机制,对于提高栽培甘草质量,指导甘草分子育种具有重要的理论价值和实践意义。本论文对60株同一栽培条件下的两年生甘草进行了 4种主要黄酮类化合物的含量测定;从含量最高的乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）及含量最低的胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）中筛选样品,利用RT-PCR法克隆CHS基因,并对其进行多态性分析;研究甘草CHS基因编码区SNP位点与甘草中黄酮类化合物含量间的相关性,筛选出甘草黄酮高/低含量对应的特异CHS基因型;构建重组酵母表达载体pPIC9K-CHS,采用电转化法将特异CHS基因导入毕赤酵母GS115菌株中,经甲醇诱导表达后,利用SDS-PAGE进行检测。本论文共取得了如下研究结果:（1）三基原甘草样品中4种主要黄酮类化合物的含量测定结果:利用HPLC法对同一栽培条件下的两年生乌拉尔甘草、光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）、胀果甘草各20株进行甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素的含量测定,发现:4种黄酮类化合物的含量均具有显著相关关系,在三基原甘草样品间均存在显著性差异,且乌拉尔甘草中含量均为最高,光果甘草次之,胀果甘草最低。将含量最高的5株乌拉尔甘草作为黄酮高含量组,将含量最低的5株胀果甘草作为黄酮低含量组,进行后续CHS基因的克隆及序列分析。（2）甘草CHS基因的克隆及序列分析结果:从黄酮高/低含量组样品中共计克隆得到336条CHS基因cDNA序列,全长均为1175 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码1条由389个氨基酸残基组成的多肽。经DNAMAN比对分析,这336条cDNA序列可确定为137种单倍型（单倍型1～137）,一致性为98.98%,存在249个变异位点;编码102种氨基酸序列类型（AA-1～AA-102）,一致性为99.40%,存在130个变异位点。在GenBank数据库中完成全部序列的注册。（3）甘草CHS基因多态性分析结果:对137种甘草CHS基因单倍型及其编码的102种氨基酸序列类型进行分析,统计结果显示:甘草的主流CHS基因型为单倍型10及92,其对应氨基酸序列类型为AA-3及AA-60;黄酮高含量组甘草样品特异主流CHS基因型为单倍型60,其对应氨基酸序列类型为AA-35;黄酮低含量组甘草样品特异主流CHS基因型为单倍型63,其对应氨基酸序列类型为AA-36。（4）甘草黄酮高/低含量组特异CHS氨基酸序列（AA-35与AA-36）的生物信息学分析结果:理化性质:甘草CHS蛋白分子量大小约为43 KDa,氨基酸序列AA-35和AA-36的等电点、不稳定系数及亲水系数差别较小,且半衰期一致。二级结构:AA-35和AA-36的二级结构仅在193位点处存在无规卷曲/延长链、225位点处存在无规卷曲/延长链、237位点处存在α-螺旋/延长链的差异,与一级结构差异较一致。且活性位点均为164位点,活性区域均为156位点至172位点之间。三级结构:AA-35和AA-36的同源模建结构均具有良好的立体化学参数和空间结构,可用于后续分析。模建蛋白结合位点分析结果显示,仅AA-35的229位缬氨酸位于结合位点区域,能够与丙二酰辅酶A结合,而AA-35的193位异亮氨酸、AA-36的193位缬氨酸与229位苏氨酸均与底物结合无关。可从分子水平上推测解释黄酮高/低含量组甘草样品中特异性CHS氨基酸序列AA-35与AA-36在193、229位点处的差异与黄酮不同水平的积累相关。聚类分析:通过构建系统进化树,发现CHS氨基酸序列在不同类别生物样本间具有良好的区分度,与其进化关系一致。甘草主流CHS氨基酸序列AA-3与AA-60先聚为一支,再与黄酮低含量组特有氨基酸序列AA-36聚为一支,最后与黄酮高含量组特有氨基酸序列AA-35聚为一支。以上聚类结果可以从进化关系层面上解释黄酮高/低含量组特有氨基酸序列AA-35/AA-36的差异明显。（5）转甘草特异性CHS基因毕赤酵母工程菌构建及表达分析:以pPIC9K为载体,构建了携带甘草特异CHS基因型的毕赤酵母GS115工程菌GS115-P-CHS10、GS115-P-CHS92、GS115-P-CHS60 和 GS115-P-CHS63,经 His+转化子、遗传霉素 G418及Mut+型重组子筛选后,利用PCR及测序法进行验证,经甲醇对验证正确的工程菌进行诱导表达后,利用SDS-PAGE进行检测,得到与甘草CHS蛋白大小一致（43 kDa）的产物,即诱导表达成功。