论文部分内容阅读
A型鸭病毒性肝炎是由鸭甲肝病毒(Duck Hepatitis A virus，DHAV)引起的一种主要感染1～3周龄雏鸭急性和高度致死性的疾病。雏鸭死亡后有明显的角弓反张神经性症状，肝脏肿大且表面有出血点或者弥漫性出血。该病毒引起的鸭病毒性肝炎呈世界性分布，且具有高度传染性，是严重危害养鸭业的主要疾病之一。随着近两年来人们对鸭病毒性肝炎的关注，DHAV的全基因组序列逐渐公布于世，但国内外学者对该病的注意力集中在病原学研究及检测方法研究，对病毒的复制及感染机制研究仍然处于上世纪的组织学和血清学水平。众多研究表明小RNA病毒科成员的复制和翻译水平与病毒的5′UTR和3′UTR具有密切的关系，且poly(A)尾结构对病毒的增殖和毒力均有重要作用。但目前尚无关于DHAV-1的poly(A)尾与病毒复制及毒力相关性的报道。本实验室前期已经构建了DHAV-1 LY0801株感染性克隆并成功获得了拯救病毒粒子，拯救病毒粒子与母本病毒具有相似的增殖能力和毒力水平。但需要进行体外转录，增加了实验繁琐性和实验经费。本课题在已经构建的感染性克隆基础上，在病毒序列的两端添加了两个具有自我剪切性质的核酶序列，构建了具有更高转染效率的DHAV-1 LY0801株DNA-Launched感染性克隆，直接转染重组质粒即可获得拯救病毒粒子。同时通过引物设计增长和缩短poly(A)尾的长度，构建一系列带有不同长度poly(A)尾的DNA-Launched感染性克隆，分别测定带有不同长度poly(A)尾的病毒的增殖和感染能力，以阐明DHAV-1 poly(A)尾对病毒增殖和毒力的影响。 1、DHAV-1 LY0801株的DNA-Launched感染性克隆的构建 参考载体pEGFP-N2多克隆位点区与DHAV-1忠实cDNA序列内部酶切位点，设计四对特异性引物将DHAV-1全基因组分为4个片段定向克隆到载体。通过引物设计的方法在病毒基因组的两端添加两个具有自我剪切性质的核酶锤头状核酶(hammerhead ribozyme)与丁型肝炎病毒核酶(hepatitis delta virus ribozyme)。通过引物设计，人工诱变第3042位碱基(T→C)并形成一个序列中本身不存在的BamHI位点，且该碱基突变未引起氨基酸序列的改变。新形成的BamHI位点作为遗传标签区分母本病毒与拯救病毒粒子。 将DHAV-1 DNA-Launched感染性克隆进行全基因组测序后发现除3042位碱基为人工诱变外，其他碱基及氨基酸序列均未发生突变。将重组质粒进行定量后直接转染BHK-21细胞，并以母本病毒感染BHK-21细胞作为阳性对照，以无菌的PBS为阴性对照。转染60h后收集细胞培养物并反复冻融三次后，接种空白BHK-21细胞。连续传代三次后，在感染60h后进行CPE的观察和IFA、RT-PCR的检测。经鉴定结果均为阳性，表明成功获得拯救病毒粒子。 2、拯救病毒的部分生物学特性研究 转染60h后收集细胞培养物，反复冻融三次后感染空白BHK-21细胞。连续传代三次后，感染6孔板中的BHK-21细胞，每隔12h分别收集细胞上清及细胞，母本病毒和无菌PBS感染BHK-21作为阳性对照和阴性对照，实时荧光定量PCR测定各个时间段病毒增殖和毒力特点。细胞和细胞上清中的增殖特点表明拯救病毒粒子和母本病毒粒子具有相似的增殖和毒力特点。 为了衡量拯救病毒与母本病毒的毒力水平，将60只雏鸭分别分为三个组。第一组和第二组分别为拯救病毒组和母本病毒组，分别腿部肌肉注射0.25ml(104TCID50)的拯救病毒和母本病毒，对照组腿部肌肉注射0.25ml无菌PBS，结果显示拯救病毒与母本病毒具有相似的毒力，死亡雏鸭表现为明显的鸭病毒性肝炎临床症状。 为了确定拯救病毒粒子与母本病毒粒子具有相似的组织嗜性，将100只雏鸭随机分为两组，分别腿部肌肉注射0.25ml(104TCID50)的拯救病毒和母本病毒粒子，攻毒后1h，6h，12h，18h，24h，48h和72h后分别收取雏鸭的心脏，肝脏，肾脏，脾脏，胸腺和法氏囊组织并用实时荧光定量PCR测定组织中的病毒含量。组织切片结果表明两组病毒均可引起典型的鸭病毒性肝炎临床症状。表明拯救病毒与母本病毒具有相似的组织嗜性。 3.Poly(A)尾的长度对DHAV-1的增殖和毒力的影响 通过引物设计的方法，将poly(A)尾的长度分别突变为0/5/10/15/20/25/30/40个碱基A，获得一系列带有不同长度poly(A)尾的DNA-Launched感染性克隆。将带有不同长度poly(A)尾的DNA-Launched感染性克隆转染BHK-21细胞后，每隔12h分别收集细胞上清和细胞，提取病毒RNA，并用DNasI消除残留DNA的影响，实时荧光定量PCR测定病毒拷贝数，并绘制生长曲线。细胞组中的增殖特点为24hpt到48hpt细胞内病毒拷贝数逐渐下降，从48hpt到60hpt病毒拷贝数又开始上升。细胞上清组中的病毒拷贝数特点为24hpt到48hpt细胞上清中的病毒拷贝数逐渐上升，而后在48hpt到60hpt病毒拷贝数又开始下降。细胞内的病毒拷贝数代表病毒在BHK-21细胞中的增殖特点，试验结果表明poly(A)25组感染性克隆具有最高的复制水平。细胞上清中本身不存在病毒RNA，因此细胞上清中的病毒拷贝数代表病毒的感染能力，试验结果表明poly(A)20组具有最高的病毒毒力水平。此外，细胞中病毒增殖特点与细胞总内容物中的增殖特点相似，表明细胞中的病毒含量远大于细胞上清中的病毒含量。 4.Poly(A)0组DNA-Launched感染性克隆拯救病毒粒子增殖特点研究 在poly(A)长度对DHAV-1增殖相关性试验中我们发现细胞组中poly(A)0组DNA-Launched感染性克隆拯救病毒粒子在48hpt后病毒拷贝数开始上升。为了确定无poly(A)尾DHAV-1能否增殖，将poly(A)0组DNA-Launched感染性克隆转染BHK-21细胞并收集细胞培养产物。细胞培养产物反复冻融三次后接种空白BHK-21细胞，连续传代三次后进行RT-PCR、IFA检测。经鉴定结果均为阳性，表明成功获得了拯救病毒粒子。这充分说明poly(A)尾对DHAV-1的增殖和感染不是必需的。 为了研究无poly(A)尾DHAV-1的增殖和毒力特点，将转染后产物分别在BHK-21细胞及健康鸭胚中传代20代，用3’RACE试剂盒分别检测不同代次poly(A)的长度，并采用实时荧光定量PCR测定病毒拷贝数。试验结果表明，无poly(A)尾的病毒基因组能够组装成完整的病毒粒子，并且可以在健康鸭胚和BHK-21细胞中增殖，但是与母本病毒相比，无poly(A)尾的DHAV-1具有较低的增殖能力和毒力。无poly(A)尾的DHAV-1在健康鸭胚及BHK-21细胞中连续传代后，从第四代开始可以重新长出稳定的由12个碱基A组成的poly(A)尾。试验结果标明poly(A)尾对DHAV-1的增殖不是必需的，无poly(A)尾的DHAV-1基因组可以增殖成有感染力的病毒粒子，并可以重新长出poly(A)尾。