目的:肺癌是导致人类癌性死亡的首位疾病,其中约80%患者为非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC),现阶段对于肺癌治疗研究以及新药开发的需求非常迫切,因此寻找更为有效和安全的治疗药物成为当前NSCLC研究的热点。中医中药治疗肿瘤具有副作用小、安全性高的特点,可以提高生活质量,在我国应用的历史悠久,范围广大。80%中药为植物来源,其中真菌性中药是重要组成部分。槐耳(Trametes robiniophila Murr.)提取物作为真菌性中药的一种,是一种复合氨基多糖,槐耳的抗肿瘤作用在肝癌性腹水的医治中被发现,现在已经广泛用于三阴性乳腺癌和肝细胞癌的医治中:在一项1000多例患者的前瞻性研究中证实了槐耳提取物颗粒剂作为肝癌切除术后辅助治疗原发性肝细胞癌的有效性,接受槐耳提取物颗粒辅助治疗的患者RFS、OS均较接受安慰剂患者延长。但槐耳提取物对非小细胞肺癌的作用及其机制却尚不明晰。增殖、转移和血管新生是恶性肿瘤的最基本的特征,本研究拟明确槐耳对非小细胞肺癌增殖、转移和血管新生的抑制作用。中草药研究中,利用生物信息学的药效物质和作用机制研究可以为基于传统实验的研究方法提供新的研究方向和研究思路。分子对接是受体和配体之间能量匹配和空间匹配而相互识别的过程,利用分子对接能够模拟药物与靶点的结合情况。本研究中我们通过生物信息学与分子对接,预测了槐耳提取物的作用靶点和槐耳提取物与靶点相关作用的方式。本研究为为NSCLC的辅助医治提供更多的可供选择药物。方法:1.通过MTT和集落形成试验,检测槐耳提取物对肺腺癌细胞系增殖的抑制作用。2.通过流式细胞术,检测槐耳提取物对细胞凋亡、细胞周期阻滞的作用。3.通过划痕试验、Transwell实验,检测槐耳提取物对肺腺癌细胞系迁移、侵袭的影响。4.在人支气管上皮细胞系中,检测槐耳提取物对正常肺上皮细胞是否产生作用。5.通过检测槐耳提取物对血管内皮细胞增殖、迁移和小管形成的影响,以检测槐耳提取物对血管生成的影响。6.在鸡胚绒毛尿囊膜模型中,通过体内实验检测槐耳提取物对血管生成的抑制作用。7.通过Pharmmapper数据库,结合既往报道的槐耳成分的分子结构,预测槐耳提取物可能的作用靶点。8.对槐耳的靶点进行GO和KEGG分析,以明确槐耳提取物靶点的整体功能。9.将槐耳靶蛋白与疾病相关蛋白取交集,以求槐耳提取物抑制非小细胞肺癌与血管新生的靶点。10.通过Western Blotting验证槐耳提取物对靶点及其下游相关分子的抑制作用。11.通过分子对接,预测槐耳提取物与靶点的结合能力。12.通过激酶活性测定,验证槐耳提取物与靶点的结合能力。13.通过裸鼠成瘤模型,在体内实验中,验证槐耳提取物对增殖、血管新生和裸鼠生存的影响,及对靶点的抑制作用。结果:1.槐耳提取物能抑制肺腺癌细胞系(A549和H1299)的增殖。2.槐耳提取物促进肺腺癌细胞系凋亡,以晚期凋亡为主,并使肺腺癌细胞系细胞周期阻滞在S期。3.槐耳提取物抑制肺腺癌细胞系的迁移和侵袭。4.槐耳提取物在常规剂量下不对人支气管上皮细胞系产生明显的增殖抑制作用。5.槐耳提取物能减弱人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的增殖、DNA复制、迁移和小管形成,同时槐耳提取物能抑制VEGF诱导的HUVECs迁移和血管新生,这些结果说明在体外槐耳提取物能抑制血管生成。6.在鸡胚绒毛尿囊膜模型中,我们发现槐耳提取物在体内也能够抑制血管生成。7.通过Pharmmapper数据库预测,我们预测到575个槐耳作用的可能靶点。8.GO分析显示靶蛋白富集在多个肿瘤相关的生物过程(BP),如metabolic process;主要定位在细胞膜,此外分子功能(MF)分析显示靶蛋白主要在蛋白连接中发挥功能。KEGG通路显示相互作用蛋白富集在代谢等通路中。9.将槐耳靶点及NSCLC、血管新生相关靶点取交集,得到32个可能的槐耳抑制肺癌和血管新生的可能靶点;其中,EGFR、VEGFR2是经典的肺癌、血管新生驱动基因,因此我们推测槐耳通过EGFR、VEGFR2抑制肺癌和血管新生。10.通过Western Blotting验证槐耳提取物对靶点的抑制作用,槐耳提取物处理后总EGFR(t-EGFR)表达量未见明显改变,磷酸化的EGFR(p-EGFR)表达量下调,GRB2表达下降,下游的Akt、ERK磷酸化水平减低、活化减少。类似的,VEGFR2总体表达量不变,磷酸化活化水平减低,下游的Src的活化同样受到抑制;同时,槐耳提取物会抑制EGF诱导的EGFR活化和VEGF诱导的VEGFR2活化。11.分子对接的结果显示槐耳提取物的有效成分可能与EGFR、VEGFR2结合来抑制其活化:槐耳提取物中的成分与阳性对照(吉非替尼、索拉非尼)均能与EGFR、VEGFR2形成相同的化学键(EGFR:氢键;VEGFR2:二硫键与π-π键),且结合过程中释放的自由能相近,由此预测槐耳提取物能够与EGFR、VEGFR2结合。12.通过激酶活性测定验证了分子对接的预测结果:槐耳提取物与EGFR、VEGFR2结合抑制活化。13.动物实验中,我们应用肺腺癌细胞裸鼠成瘤模型,发现槐耳提取物抑制了肺癌小鼠皮下移植瘤的生长,延长了荷瘤小鼠的生存时间,下调了增殖相关标记物Ki-67和血管生成相关标记物CD34的表达,并且下调了p-EGFR的表达,而t-EGFR表达未见显著变化,且裸鼠服用槐耳提取物耐受性良好。结论:槐耳可能通过EGFR、VEGFR2抑制下游通路激活,抑制NSCLC增殖和血管新生。基于槐耳低毒、多靶点的特点和体内外实验中抑制NSCLC增殖、血管新生的事实,槐耳有可能成为肺癌辅助治疗中药。这些发现为进一步了解槐耳提取物分子功能提供了新的思路,并表明其作为NSCLC治疗药物的潜力。