杜仲(Eucommia ulmoides Oliv)是中国特有的中药材和工业原料植物,研究发现杜仲皮和杜仲叶中含有大量的药用成分,能治愈多种疾病。因此其在天然药物领域内研究十分活跃,其综合开发利用的前景更是十分广阔。随着生物酶研究的不断深入,应用领域的发展,利用酶工程技术来提取杜仲中的天然成分的方法得到越来越多研究者的认同。在研究植物病菌致病机理时,发现其产生的角质酶可以破坏寄主植物中的角质层。因此,本课题组有针对性的选育了能有效降解杜仲叶表面角质层的菌株,经鉴定为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。在对胶红酵母的生长特性有所了解后,开始诱导胶红酵母发酵产角质酶的研究。据文献报道,一般所采用的诱导剂为植物角质,而角质制作工艺复杂,对角质酶的大规模应用构成了限制,所以,寻找可替代角质的诱导物势在必行。在进行多次试验后发现,使用亚麻油做诱导剂效果较好,且亚麻油廉价易得,大大减少了生产成本及工作量,提高了研究效率。为了更好的将此法应用到生产实践中,本文主要做了以下工作:1.对橄榄油、菜籽油、亚麻油和角质的诱导效果进行对比,通过测定酶活性筛选合适的诱导物高效诱导产酶。对比发现,亚麻油为诱导物时酶活性高于其他诱导物,是未加诱导剂时酶活的1.5倍。因此,以亚麻油为诱导物继续对诱导的发酵条件进行了详细的研究,设计单因素实验对培养基条件和环境因素进行探索,最终通过正交实验确定了诱导发酵产酶的工艺参数,在此条件下,酶活性比优化前提高了近5倍。2.研究了胶红酵母角质酶的酶学性质。主要包括角质酶的最佳反应温度,热稳定性,最佳pH,pH稳定性,以及一些常见金属离子对角质酶活性的影响。3.杜仲叶的联合酶解。利用角质酶与蛋白酶、果胶酶、纤维素酶联合提取杜仲叶中的天然成分。在经上述四种酶依次处理后,将各步得到的酶解液分别收集,经过滤、浓缩、乙醇提取,最后负载至β-环糊精上,制成杜仲原粉。用高效液相色谱法对杜仲原粉中的绿原酸进行了分析测定,确定了检测方法,并证实经角质酶处理后所提取的绿原酸含量要高于未处理的,说明此酶解法有效。