化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes,T.pyogenes）是一种常见于动物呼吸道、消化道黏膜和乳房的共生性细菌。同时,T.pyogenes也是一种条件性致病菌。当动物处于应激性状态下时,T.pyogenes能引起动物发生多种炎症疾病。化脓隐秘杆菌溶血素（Pyolysin,PLO）是T.pyogenes分泌的唯一一种溶血素,是一种胆固醇依赖性溶细胞素（Cholesterol-dependent cytolysin,CDCs）,也是一种成孔毒素（Pore-forming toxin,PFT）。已有研究表明,PLO接种小鼠可以引发炎症。但是,PLO导致炎症的机制仍不明确,而阐明其引发炎症的机制对于全面揭示T.pyogenes的致病机制有一定的积极意义。本研究表达纯化了重组PLO（Recombinant PLO,rPLO）、突变体蛋白rPLO W497F和rPLO D238R,以及截短蛋白rPLO D123、rPLO D4和rPLO D4 W497F,并对它们的溶血活性进行分析。结果表明rPLO的溶血活性最强,其次为rPLO D238R,rPLO W497F及截短蛋白rPLO D123、rPLO D4和rPLO D4 W497F几乎没有溶血活性。用不同浓度的重组蛋白处理J774A.1细胞检测细胞毒性结果表明,rPLO蛋白在30-60 ng/mL浓度范围内细胞毒性较低,而随着浓度的增加细胞毒性逐渐增强;突变体蛋白rPLO W497F及rPLO D238R几乎不表现细胞毒性。重组蛋白处理与钙离子(Calcium,Ca²⁺)荧光探针孵育的J774A.1细胞,结果表明亚裂解剂量rPLO处理的细胞内Ca²⁺浓度下降,rPLO D238R和rPLO W497F处理的细胞中Ca²⁺浓度显著高于rPLO处理的细胞。用含有不同浓度Ca²⁺的细胞外液与rPLO共处理细胞,结果表明当细胞外液中含有1 mmol/L Ca²⁺时,rPLO处理可以导致细胞中的Ca²⁺浓度下降;当细胞外液中Ca²⁺浓度低于正常浓度时,rPLO作用可以导致细胞中的Ca²⁺浓度上调。用不同浓度的rPLO处理J774A.1细胞0.5 h,检测表明30-60 ng/mL的rPLO对细胞钙蛋白酶（Calpain,CAPN）的活性没有明显的影响,当时间延长至2 h时,细胞内CAPN活性被显著地抑制。用亚裂解剂量的rPLO处理J774A.1细胞,western-blot检测表明rPLO可以显著抑制NF-κB p65的磷酸化及NFATc1的表达,并且处理细胞0.5 h就能表现显著的抑制效果;rPLO D238R和rPLO W497F处理组的细胞中NF-κB p65的磷酸化水平及NFATc1的表达有所上调。用亚裂解剂量的rPLO与不同浓度Ca²⁺外液共同处理J774A.1细胞,结果表明在含有1 mmol/L CaCl₂的RPMI1640培养基中,由rPLO导致的细胞中NF-κB p65磷酸化水平降低的现象有所缓解,NFATc1的表达水平上调。用亚裂解剂量的rPLO处理J774A.1细胞,检测细胞中非经典NF-κB信号通路中几个关键性蛋白,结果表明在0.5 h时NIK及p52的含量增加,p100与IKKα/β的磷酸化水平提高。用不同重组蛋白处理小鼠骨髓源性巨噬细胞（Bone marrow derived macrophages,BMDMs）,检测细胞中钙调神经磷酸酶（Calcineurin,CN）的活性,结果表明所有重组蛋白均不会显著影响细胞中CN活性。用不同蛋白处理BMDMs,结果表明rPLO可以刺激细胞产生大量的IL-1β;rPLO W497F及rPLO D123可以刺激细胞产生大量的IL-10。然后用重组蛋白刺激tlr4基因缺失的BMDMs(BMDMs^tlr4-),结果表明rPLO仍可刺激细胞产生大量的IL-1β;而rPLO W497F和rPLO D123对IL-10诱导能力由于tlr4基因的缺失受到完全抑制。用PLO蛋白D123结构域的截短多肽处理BMDMs,结果表明rPLO 95-156可以上调BMDMs中IL-10的大量表达。综上所述,本实验证明了PLO作用巨噬细胞（Macrophages,Mφ）可以通过两种方式影响NF-κB信号通路。当PLO维持完整的结构和功能时,可以通过“成孔活性”激活非经典NF-κB信号通路;而在细胞膜结合功能受损的情况下,PLO表现“PAMPs样活性”通过刺激MφTLR4活化经典NF-κB信号通路,介导细胞因子的表达。本研究为全面理解T.pyogenes导致感染性炎症的机制提供部分理论依据。