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牛结核病（Bovine Tuberculosis,bTB）是一种由结核分枝杆菌复合群（MTBC）引起的牲畜和其他哺乳动物间的慢性传染性疾病,牛分枝杆菌（M.bovis）和结核分枝杆菌（M.tuberculosis）为该病的主要病原菌。目前bTB已对世界范围内多个国家的养牛业造成了巨大的经济损失,同时也对人类公共卫生安全造成了巨大的威胁。从卡介苗（BCG）的首次应用到现在已有100年的历史,但是目前对成人结核病和牛结核病仍然没有有效的防控措施,其主要原因是MTBC的临床感染机制复杂,致病机理尚未完全解析,究其原因之一,可能是不同型的结核分枝杆菌感染宿主肺泡巨噬细胞的先天免疫应答存在差异。为此,本研究以牛分枝杆菌临床株和人结核分枝杆菌临床株为材料,分离原代牛肺泡巨噬细胞（bovine alveolar macrophages,bAMs）并建立感染模型,通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）和生物信息学方法,在蛋白质组学水平上解析M.bovis与M.tb临床株的差异,以及感染牛原代bAMs的先天免疫应答机制;同时结合细菌的蛋白质组学和最新的研究,我们筛选结核分枝杆菌细胞壁蛋白Mtb39a（PPE18）为研究对象,构建原核表达载体,纯化蛋白和活性分析等,并通过Western-blot检测健康和临床结核病患者血清的反应性,揭示其是否可作为结核病临床诊断标识物。为探究M.bovis与M.tb感染引起牛结核病的致病机制提供理论参考。通过研究获得以下结果:1.在M.bovis与M.tb蛋白质组学分析中共鉴定出9个差异蛋白,其中三个为上调蛋白（007412、O53873、P9WKI3）,6 个为下调蛋白（P9WGI5、P9WH33、P9WH39、P9WH87、P9WHC5、P9WQD1）。GO功能注释发现,M.bovis与M.tb差异上调蛋白在细胞质膜、细胞外围和细胞内的细胞组成均有注释;主要参与M.bovis的大分子代谢相关的生物进程,与能量代谢相关。亚细胞定位显示,其中一种蛋白定位在细胞膜上,两种蛋白定位在细胞质中。COG分析表明差异上调蛋白与核苷酸转运和代谢,复制、重组和修复,次生代谢产物生物合成有关。KEGG通路分析,分析M.bovis与M.tb)差异上调蛋白定位到药物代谢和核苷酸切除修复两条通路上。M.bovis vs.M.tb差异下调蛋白主要集中在与核糖体结构组成相关的一系列细胞成分中,参与了 M.bovis核糖体的组成,与细胞内蛋白质的合成密切相关。此外,这6种下调蛋白,激活了与核糖体结构组成相关的分子功能,与M.bovis和M.tb的核糖体生物发生相关,富集在药物和其他酶代谢的通路中。蛋白互作网络展示出,在M.bovisCvsM.tbC组中只有下调蛋白P9WH39、P9WH87、P9WH33、P9WHC5发生了相互作用。2.在M.bovis与M.tb蛋白质磷酸化组学分析中共鉴定到21个差异磷酸化蛋白。GO富集分析发现M.bovis与M.tb差异蛋白质磷酸化修饰显著富集在与大分子代谢相关的生物进程中,分子功能与分子结合相关,在细胞组成方面,差异蛋白质磷酸化修饰几乎存在于细胞的所有部位。3.使用M.bovis与M.tb分别感染BAM 6h,然后对BAM进行蛋白质组分析。结果发现,在M.tb感染组中,有17种蛋白质被上调,1种蛋白质被下调;M.bovis感染组中,有60种蛋白质被上调,3种蛋白质被下调。在M.bovis和M.tb攻击BAM后,都会激活巨噬细胞的自噬相关进程,炎性相关进程和对病原菌的防御进程。同时,在M tb感染BAM后,BAM中的能量代谢急剧激活。M.bovis感染BAM后,可引起细胞内参与能量代谢、自噬、凋亡、溶酶体和炎症的蛋白表达变化,差异蛋白主要参与各种能量代谢、自噬和免疫相关的途径,包括结核病、溶酶体、吞噬体、Th17细胞分化和氧化磷酸化。4.通过构建Mtb39a原核表达载体,实现Mtb39a重组蛋白的原核表达。并通过Western-blot检测发现纯化后的Mtb39a重组蛋白临床结核病患者血清具有反应性而对健康血清则没有反应性。结论:1.确定了M.bovis与M.tb的差异蛋白主要定位在细胞质中,可能参与核糖体的调控与组装,并集中在药物和其他酶代谢通路中,可能与M.bovis复制合成和耐药性有关。2.M.bovis与M.tb差异磷酸化蛋白主要定位在细胞质、细胞外围与质膜区域,参与分枝杆菌的代谢进程,具有高度的结合功能可能与M.bovis致病性与宿主细胞内适应性有关。3.确定了BAM在防御M.bovis与M.tb感染时可以做出不同的反应,包括对各种自噬和炎症相关的进程以及信号通路的激活。此外,M.bovis可抑制BAM的自噬和炎症相关蛋白及信号通路,避免被BAM清除,从而在宿主中定植。而M.tb感染BAM时,细胞内能量代谢急剧激活,这可能是BAM针对M.tb攻击而进行主要防御活动。4.初步推测Mtb39a重组蛋白可能可以作为潜在的M.tb诊断标识物。以上这些结果在蛋白质水平上解析了M.bovis与M.tb临床株的差异,揭示了 BAM被M.bovis与M.tb感染时表现出的免疫应答差异,同时展示了 Mtb39a可能可以作为潜在的结核病临床诊断标识物。为研究不同分枝杆菌的感染机制提供理论依据,为研究M.bovis与M.tb的毒力差异奠定基础,对于防治TB制定新的策略具有重要意义。