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抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome, APS)是一种系统性自身免疫性疾病,血清抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody, aPL)阳性和血栓前状态为APS的两大重要血清学特征,这种血清学特征与栓塞的发生和病理妊娠密切相关。APS发病机制不明,血栓形成一直以来被认为是APS发病的重要因素,而内皮细胞活化则是血栓形成的重要原因。抗体浓度及感染与APS的发病及预后关系密切,国内外学者普遍认为中高浓度情况下,浓度越高、病情越重、预后越差,感染则可加重APS病情。导致此种现象的机制未明,内皮细胞是否参与其中,国内未见此方面研究。aPL活化内皮细胞具有特定的信号传导通路,并非简单的磷脂结合途径。大部分aPL直接与β2糖蛋白I (β2GPI)结合,aPL/β2GPI复合物进一步结合于细胞表面。目前细胞的Toll样受体(TLR)信号传导通路尤其是TLR2和TLR4信号通路是研究的热点,国外研究发现TLR2参与aPL活化内皮细胞的信号传导中,而TLR4是否参与其中存在争议,国内未见相关研究。内皮细胞活化后可分泌多种细胞因子,本文选择E-选择素(SELE)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素8(IL-8)四种常用且敏感的指标用以监测内皮细胞活化后的分泌功能,其中E-选择素mRNA表达量增加或降低时,其蛋白的表达水平发生相应的上调或下调,因此本文分别从mRNA及蛋白水平对E-选择素的表达进行检测,若二者的表达均增加或减少,则从一方面说明了实验结果正确性。本文所采用的aPL为从APS患者血清中提纯的IgG,为排除正常IgG对实验的影响,选择正常人群血清中提纯的IgG作为正常对照。本文拟分为三个部分,第一部分体外培养脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),分别用正常对照IgG及不同浓度APS患者IgG刺激细胞,探讨不同浓度aPL对内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、IL-8、MCP-1的影响。第二部分探讨TNF-α干预下内皮细胞TLR2/4表达情况其TNF-α干预下aPL对血管内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、IL-8、MCP-1的影响,进一步研究APS血管内皮细胞活化的机制,并为治疗APS提供新靶点。第三部分通过研究卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)对aPL刺激内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、IL-8、 MCP-1的影响,探讨BCG-PSN是否有可能成为治疗APS的新选择药物。第一章不同浓度抗磷脂抗体对内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、IL-8. MCP-1影响的研究目的：观察不同浓度抗磷脂抗体对血管内皮细胞分泌功能的影响。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞,分别用PBS(空白组)、正常人血清提取的IgG(正常对照组)和不同浓度APS患者血清提取的IgG (APS IgG)(5%、10%和20%)干预细胞。采用实时荧光定量PCR及流式细胞学技术,检测细胞E-选择素的表达,采用酶联免疫吸附试验测定细胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表达,采用Western blot检测内皮细胞TLR2和TLR4的表达。结果：正常对照组内皮细胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表达量与空白组比较,无统计学差异(p>0.05); APSIgG可诱导内皮细胞SELE. MCP-1、IL-6和IL-8表达增加,与空白组、正常对照组比较及不同浓度APS IgG组之间两两比较,差异有显著统计学意义(p<0.01)；空白组、正常对照组及5%APS IgG组两两比较,内皮细胞TLR2表达量无明显差异(p>0.05),10%及20%APS IgG组TLR2表达量与空白组及正常对照组比较及两组之间比较,差异有统计学意义(p<0.05)；各组之间TLR4表达量无明显差异(p>0.05)。结论：抗磷脂抗体刺激内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、IL-8、 MCP-1增加且作用具有浓度依赖性,浓度越高,作用越强。第二章TNF-a对内皮细胞TLR2/4表达的影响及APS发病机制的研究目的：探讨TNF-a干预下aPL刺激内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、IL-8、 MCP-1的情况及TLR2和TLR4在抗磷脂抗体刺激内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、IL-8、MCP-1中的作用。方法：(1)一半细胞采用肿瘤坏死因子a (TNF-a)预刺激24小时后去除刺激因素8小时,一半细胞未经TNF-a预刺激但余处理相同,收集一部分TNF-a预刺激及未预刺激细胞,采用Western blot检测TNF-a预处理对内皮细胞TLR2和TLR4表达的影响,余下的TNF-a预刺激及未预刺激细胞分别用脂磷壁酸(LTA)、正常对照IgG及不同浓度APS IgG(5%、10%和20%)进行干预,采用实时荧光定量PCR及流式细胞学技术,检测细胞E-选择素的表达,采用酶联免疫吸附试验测定细胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表达；(2)分别加入抗-TLR2或(和)抗-TLR4阻断抗体阻断TLR2或(和)TLR4信号传导通路后,用20%浓度APS IgG干预细胞,采用实时荧光定量PCR及流式细胞学技术,检测细胞E-选择素的表达,采用酶联免疫吸附试验测定细胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表达。结果：经TNF-a预刺激后,细胞TLR2表达量较未经TNF-a预刺激细胞明显增加,差异有统计学意义(p<0.01),TLR4表达量无明显变化(p>0.05)；经TNF-a预处理及未预处理细胞均用TLR2特异性激动剂LTA进行干预,经TNF-a预处理组SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表达量较未经TNF-a预处理组明显增高,差异有统计学意义(p<0.01)：经TNF-a预刺激后再用同浓度APS IgG干预细胞,SELE、 MCP-1、IL-6和IL-8表达量与仅用APS IgG干预组比较明显增高,差异有统计学意义(p<0.01),不同浓度APS IgG组与正常对照组四组之间两两比较,差异均有统计学意义(p<0.01)；抗-TLR2+APS IgG组及抗-TLR2+抗-TLR4组内皮细胞SELE、 MCP-1、IL-6和IL-8表达量,较APS IgG组明显降低,差异有统计学意义(p<0.01)；抗-TLR4+APS IgG组内皮细胞SELE. MCP-1、 IL-6和IL-8表达量,与APS IgG组比较无明显改变,差异无统计学意义(p>0.05)。结论：(1)TNF-a干预下抗磷脂抗体刺激内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、 IL-8、MCP-1的作用增强。(2)抗磷脂抗体通过TLR2信号传导通路刺激内皮细胞使其E-选择素、IL-6、IL-8、MCP-1分泌增加。第三章卡介菌多糖核酸对抗磷脂抗体刺激内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、IL-8、MCP-1的影响目的：探讨卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)干预下抗磷脂抗体刺激内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、IL-8、MCP-1的情况。方法：用APS患者血清提取的IgG处理内皮细胞,APS IgG处理前预先加入不同浓度BCG-PSN(0、25、50和100μg/ml),采用实时荧光定量PCR及流式细胞学技术,检测细胞E-选择素表达,采用ELISA测定细胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表达。结果：BCG-PSN干预下APS IgG所诱导的内皮细胞SELE.MCP-1、IL-6和IL-8表达明显降低,APS IgG组及不同浓度BCG-PSN组之间两两比较,差异均有统计学意义(p<0.01)。结论：卡介菌多糖核酸干预下抗磷脂抗体刺激内皮细胞分泌E-选择素、IL-6、IL-8、MCP-1的作用减弱,提示它可以用于APS的治疗。