第一部分过量氟对机体内骨钙素含量与糖代谢的影响目的:探讨不同剂量氟作用于机体后对骨钙素及糖代谢的影响。方法:1.选取确诊为氟骨症的65例患者为氟骨症组,诊断无骨病变且排除相关骨骼疾病的其他65例病人作对照组。记录一般情况,计算体质指数(Body Mass Index,BMI),酶联免疫吸附实验法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清总骨钙素(total Osteocalcin,t OCN)、未羧化骨钙素(uncarboxylated Osteocalcin,ucOCN)、空腹胰岛素(Fasting Insulin,FINS)含量,化学法测定血糖(Glucose,GLU)、糖化血清蛋白(Glycated serum protein,GSP)含量,计算胰岛素抵抗指数(Insulin resistence index,HOMA-IR)。2.18-24g的C57雄性小鼠36只分为3组,0 mg/L、100 mg/L、150 mg/LNaF干预,2、4、6、8、10、12 W后检测体质量。12 W后化学发光法检测血糖、糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin,Hb A1c)含量,ELISA法检测t OCN、ucOCN、FINS、胰高血糖素(Glucagon)含量。苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色观察胰腺病理学变化,免疫组化检测胰腺骨钙素(Osteocalcin,OCN)、周期蛋白D2(Cyclin D2)的表达。结果:1.氟骨症组与对照组比较ucOCN、FINS、GSP明显增高(P<0.05)。氟骨症组t OCN、HOMA-IR高于对照组,但无统计学意义(P>0.05)。氟骨症组GLU低于对照组无统计学意义。相关回归分析显示ucOCN与FINS呈正相关(P<0.05)。ucOCN与GLU、HOMA-IR呈负相关(P<0.05),ucOCN与BMI、t OCN、GSP无相关性(P>0.05)。2.(1)各染氟组间t OCN、ucOCN含量比较差异均有统计学意义(F=32.31、17.41,P均<0.05)。其中各染氟组小鼠t OCN、ucOCN均高于对照组。组间GLU比较差异均有统计学意义(F=22.75,P均<0.05),其中各染氟组小鼠GLU均高于对照组。组间Hb A1c、Glucagon、FINS含量比较差异均有统计学意义(F=102.40、73.61、5.32,P均<0.05),其中各染氟组Hb A1c、FINS均高于对照组。各染氟组Glucagon含量均低于对照组。ucOCN与t OCN、FINS呈正相关,与GLU、Hb A1c呈负相关,与Glucagon无相关性。(2)病理学检查:150 mg/L染氟组腺泡细胞形状偶见不规则,少量细胞界限稍模糊,部分胰岛细胞细胞核变少,分布较稀疏。(3)染氟组小鼠胰腺中OCN表达呈阴性,Cylin D2的表达呈阳性。结论1.过量氟可导致氟骨症患者与小鼠血清2ucOCN显著升高,表现为骨组织增殖的骨相损伤。2.过量氟可导致氟骨症患者与小鼠糖代谢紊乱,表现为糖代谢异常的非骨相损伤。3.过量氟作用时,ucOCN与FINS有相关性。第二部分不同剂量氟对体外培养胰岛β细胞功能的影响目的:观察不同剂量氟化钠(NaF)对体外培养的小鼠胰岛β细胞增殖活力和胰岛素(Insulin,INS)分泌的影响。方法:0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/LNaF分别干预小鼠胰岛Beta-TC-6细胞24 h、48 h、72 h、96 h后,HE染色观察细胞形态,噻唑蓝(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2-H-Tetrazolium Bromide,MTT)比色法检测细胞增殖活力;ELISA法测定胰岛素分泌变化。结果:0.5 mg/L、1.0 mg/LNaF作用72 h时,可使胰岛β细胞增殖活力和胰岛素分泌较对照组明显增强(P(27)0.05);≥8.0mg/L时随着NaF剂量的增加和作用时间的延长,细胞增殖活力和胰岛素分泌明显减弱(P(27)0.05),且细胞生长逐渐缓慢,数量减少,不易贴壁或融合成片,多呈椭圆或圆形细胞。结论:低剂量NaF促进胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌,随着剂量增大和时间延长,过量NaF对细胞增殖活力和胰岛素分泌能力的抑制逐渐增强,呈剂量效应关系。第三部分ucOCN-GPRC6A通路阻断后过量氟对体外培养胰岛β细胞功能的影响目的:阻断(未羧化骨钙素-G蛋白耦联受体C家族6组成员A,uncarboxylated Osteocalcin-G protein coupled receptor family C,Group 6,subtype A,ucOCN-GPRC6A)通路后,观察过量氟对体外培养小鼠胰岛Beta-TC-6细胞INS分泌、增殖能力的影响,探讨氟是否通过ucOCN-GPRC6A通路影响小鼠胰岛β细胞功能。方法:选取ucOCN-GPRC6A通路阻断和未阻断两组小鼠胰岛Beta-TC-6细胞,8 mg/LNaF、150mmol/LucOCN、8 mg/L NaF+150 mmol/LucOCN分别干预48 h,ELISA法测INS含量,提取总RNA、蛋白,RT-PCR、Western blot法检测Cyclin D1、Cyclin D2表达。结果:1.非转染:INS分泌水平,Cyclin D1、Cyclin D2m RNA、蛋白的表达NaF组较空白组显著降低(P(27)0.05),ucOCN组INS分泌水平,Cyclin D1、Cyclin D2m RNA、蛋白的表达较空白组升高,NaF+ucOCN组INS分泌水平,Cyclin D1、Cyclin D2m RNA、蛋白的表达较空白组、ucOCN组降低,较NaF组升高。2.转染:ucOCN组INS分泌水平、Cyclin D1、Cyclin D2m RNA、蛋白的表达较空白无显著差异。NaF+ucOCN组INS分泌水平,Cyclin D1、Cyclin D2m RNA、蛋白的表达较空白组降低(P(27)0.05),较NaF染毒组无统计学意义。3.两组间比较:非转染ucOCN组较转染ucOCN组INS分泌水平,Cyclin D1、Cyclin D2m RNA、蛋白的表达显著升高(P(27)0.05);非转染NaF+ucOCN组较转染NaF+ucOCN组INS分泌水平,Cyclin D1、Cyclin D2m RNA、蛋白的表达显著升高(P(27)0.05);非转染空白组、NaF染毒组与转染空白组、NaF染毒组INS分泌水平,Cyclin D1、Cyclin D2m RNA、蛋白的表达无显著差异。结论:1.ucOCN能够减轻过量氟对胰岛细胞的损伤效应。2.氟可通过ucOCN-GPRC6A通路作用于胰岛细胞。