凤丹(Paeonia ostii)是我国著名的药用牡丹,其干燥的根皮(“凤丹皮”)是我国常用的大宗中药材;凤丹根系发达,抗逆性强,是观赏牡丹嫁接繁殖的优良砧木;其结籽率高,种子可用于榨取牡丹籽油,是油用牡丹的主要品种。随着牡丹籽油产业的发展,对凤丹种苗的需求急剧增加,目前出现供不应求的现象。凤丹种子具有很深的上胚轴休眠特性,需经自然低温打破上胚轴休眠方可萌发,自秋季播种需经7个月左右才能萌发成苗,严重制约了凤丹种苗的生产。目前,打破凤丹种子上胚轴休眠常用的方法有低温处理(物理刺激)和赤霉素处理(化学刺激),两种不同的刺激可能会对种子内部的生理代谢产生不同的影响,但目前对其生理代谢差异缺乏系统的比较分析。本文在前人和本实验室研究的基础上筛选出两种打破凤丹种子上胚轴休眠的最优处理:4℃低温处理27天和300mg.L-1 GA3浸种24小时。研究感受低温过程中凤丹种子内含物质的变化及低温和GA3同步处理下凤丹种子上胚轴发育及生理特性差异,为生产上快速培育优质壮苗提供技术支持。本实验主要研究结果如下:1.感受低温过程中凤丹种子内含物质的变化以当年采收的凤丹成熟种子为实验材料,在暖温层积后种子根长达4cm时,设置人工低温27天打破上胚轴休眠的处理,研究低温处理期间(3、10、18、27)凤丹种子内部的生理代谢变化。与未经任何处理的对照相比,低温处理的凤丹种子随着时间延长,胚中淀粉含量持续升高,至处理结束时含量达到最大;可溶性糖含量持续升高,3-10天时升幅最大,之后升幅渐缓;可溶性蛋白的含量一直降低。在胚乳中三种物质的含量都有所下降,且淀粉含量是呈持续下降状态,而可溶性糖含量是在3-10天升高,之后一直呈下降状态,可溶性蛋白含量下降一直较缓慢,但总体含量变化不明显。由于这三种物质在凤丹种子的形态建造过程中都发挥着重要的作用,说明此阶段种子的生理代谢较缓慢,因此未导致种子上胚轴形态的变化。四种内源激素(IAA、GA、ZR、ABA)在人工低温处理过程中均发生了变化,表现为随处理时间的延长IAA、GA、ZR含量在胚中升高,ABA含量在胚中下降。在低温处理中,ZR含量是先降低再升高,IAA含量则是一直升高,GA含量是在10-18天期间有所下降之后又继续升高。处理结束时,IAA、GA含量在胚乳中升高,ZR、ABA含量在胚乳中降低。四种激素在凤丹种子上胚轴休眠的过程中起着协同促进作用,共同促进种子的萌发。但此时种子形态未发生变化,后续凤丹种子生长萌发状况有待于进一步试验观察。2.低温和GA3同步处理下凤丹种子上胚轴发育及生理特性差异研究了 4℃低温27天和300mg·L-1 GA3浸泡种子24h两种处理对种子后续生长的影响,结果表明:这两种处理都能有效地打破凤丹种子上胚轴休眠,缩短上胚轴萌发时间,但低温和赤霉素处理的凤丹种子形态变化有所不同,低温处理的种子上胚轴圆厚,子叶生长缓慢;赤霉素处理的种子上胚轴细长扁平,子叶生长较快,利用胚乳效率高。两种处理均提高了胚中的淀粉和可溶性糖含量,降低了可溶性蛋白含量,淀粉含量升高幅度在3-8天时最大,可溶性糖含量升高幅度也是在3-8天时最大,之后升幅趋缓,可溶性蛋白含量降幅在3-8天时最大,这两种处理均降低了胚乳中这三种物质的含量,且淀粉和可溶性糖含量的降低幅度在3-8天时最大,而可溶性蛋白降幅整体较缓慢。同时,两种处理在胚及胚乳中有效地提高了促进类激素(ZR、IAA、GA)含量,降低了抑制类激素(ABA)含量。且低温处理的各项形态和生理指标均优于赤霉素处理。可推断低温处理使凤丹种子后续生长更具潜力。3.低温和GA3同步处理打破凤丹种子上胚轴休眠时蛋白组分的差异种子发育过程的不同时期,差异表达蛋白质会表现出不同的功能性。本实验对4℃低温处理27天和300mg.L-1 GA3浸泡种子24h两种处理的凤丹种子胚及胚乳进行了 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳分析。结果表明:在低温和GA3处理的胚中发现六条差异蛋白表达,分子量分别在60-80 kDa、30-40kDa、20-30 kDa、12-20 kDa,在胚乳中发现五条差异蛋白,分子量分别在50-60 kDa、30-40kDa、20-30 kDa。这些差异蛋白的表达可能是导致种子打破上胚轴休眠时间快慢的重要因素。但具体是那些分子量的差异蛋白表达还有待于后续进一步实验研究。