茶树CsSPI和灰茶尺蠖EgGL的基因克隆和功能研究

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:mamao844661
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植物丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor,SPI)具有重要的抗病虫功能,但其在茶树上的抗病虫功能研究尚未见报道。灰茶尺蠖Ectropis grisescens不仅是茶尺蠖Ectropis obliqua的近缘种,也是茶业生产的主要害虫之一。有关茶树不同品种对灰茶尺蠖的抗性研究较少,而植食性昆虫唾液激发子在植物防御反应中发挥了重要作用。研究茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的抗病虫功能及灰茶尺蠖葡萄糖苷酶在茶树诱导防御反应中的作用,可为今后茶树抗性品种的选育、灰茶尺蠖与茶树之间的协同进化关系等研究提供科学依据。本论文通过基因克隆的方法获得了茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和灰茶尺蠖葡萄糖苷酶基因,并对这两个基因的表达特征进行了分析。通过昆虫各生长发育指标测定了茶树不同品种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性和丝氨酸蛋白酶抑制剂SPI的抗虫功能。采用RNA干扰技术,构建了L4440-EgGL重组表达载体。研究结果如下:  (1)通过RT-PCR技术克隆获得了全长为1669bp的茶树CsSPI基因,包含一个1170bp的最大开放阅读框,编码389个氨基酸残基组成的多肽,理论分子质量为42.43kD,理论等电点为6.36。与其它物种中的丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列比对分析表明,该基因含有这类家族基因的保守区域。对CsSPI的表达特征分析表明,茶树CsSPI基因在花中的表达量最高,在恩标品种中叶部、茎部的表达量最高。  (2)经比对不同茶树品种间灰茶尺蠖幼虫和蛹的生长发育指标表明,恩标和紫笋为灰茶尺蠖的抗性品种,而斑竹园和蓝天为感性品种。而恩标和紫笋中丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性显著高于斑竹园和蓝天,表明茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达水平可能与其对灰茶尺蠖的抗性有关。  (3)克隆获得了全长为2717bp的灰茶尺蠖EgGL基因,其中包含一个2490bp的最大开放阅读框,编码829个氨基酸残基组成的多肽,理论分子质量为94.99kD,理论等电点为8.71。氨基酸序列比对显示与茶尺蠖E.obliqua的相似性高达98%,为近缘种。  (4)利用基因重组技术构建了L4440-EgGL表达载体,并将其转入大肠杆菌HT115(DE3)中。
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