研究背景:子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)是育龄期女性中常见的妇科疾病,以疼痛、不孕、月经异常、盆腔包块为主要临床表现,严重影响女性健康和生活质量。其特征是病变广泛,形态多样;极具浸润性,可形成广泛而严重的粘连;具有激素依赖性,易于复发。近年来发病率呈明显上升趋势,在临床治疗上具有一定难度。在子宫内膜异位症的发病和疾病进展过程中,涉及黏附、入侵、增殖、侵袭、血管生成等诸多方面调控异常,发病机制目前尚不明确。核转录因子-kappaB(nuclear factor-KB,NF-κB)是一种重要的核转录因子,存在于多种细胞类型中,广泛参与多项生理和病理过程的基因调控,包括炎症、免疫、细胞增殖、凋亡和胚胎发生等。在子宫内膜异位症中,有研究人员发现NF-κB介导的信号通路可以诱导子宫内膜异位症的发生。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血小板衍生的生长因子,在内异位症病灶的形成过程中发挥重要作用,参与子宫内膜细胞异位定植过程中的血管形成,为子宫内膜细胞提供营养支持。MicroRNAs(miRNAs)是一类小的内源性RNA分子,长度为22-23个核苷酸且具有重要的调节功能,近年来已在真核生物中鉴定出多种发挥重要功能miRNAs,它们广泛参与细胞的增殖分化、细胞凋亡、器官发育、代谢等生理过程,同时与肿瘤细胞的生物学行为及特性密切相关。研究表明,miRNAs在子宫内膜异位症中扮演着重要的角色,研究子宫内膜异位症发生发展过程中具有重要功能的miRNA可以为子宫内膜异位症的诊断、治疗和预后提供有效的帮助。miR-138是近年来新发现miRNA家族成员,在多种不同类型的肿瘤组织中呈现低表达,具有肿瘤调控作用,但目前其在子宫内膜异位症中的研究甚少。在本研究中,我们将从子宫内膜异位症的动物模型出发,利用miRNA基因芯片筛查子宫内膜异位症中异常表达的miRNA,并通过qRT-PCR的方法证实miR-138在子宫内膜异位症中表达情况。在生物学功能方面,我们利用细胞模型研究miR-138在子宫内膜异位症中对细胞增殖、凋亡以及炎症反应的影响。在具体作用机制方面,我们通过分子生物学实验探讨miR-138在子宫内膜异位症中可能的潜在机制。具体研究如下:第一部分 MicroRNA-138在子宫内膜异位症中的表达变化研究目的:研究miR-138在子宫内膜异位症中的表达情况,检测子宫内膜异位症动物模型中炎症相关细胞的变化。研究对象:16只重症联合免疫缺陷SCID小鼠(20±2g;雌性;8-9周龄)在标准条件下(22-24℃)以12小时的光/暗循环常规饲养。通过随机化数字表的方式进行随机分组,分为实验组(Ems组)和对照组,每组8只重症联合免疫缺陷小鼠。研究方法:通过构建子宫内膜异位症动物模型,利用miRNA基因芯片的方法高通量地检测子宫内膜异位症中差异表达的miRNA,并利用实时定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法验证 miR-138 在子宫内膜异位症中的表达情况。利用流式细胞仪检测子宫内膜异位症动物模型腹腔液中CD11b阳性细胞的数量。研究结果:1.采用miRNA基因芯片方法高通量检测了子宫内膜异位症模型小鼠中miRNAs的表达情况,发现miR-138在子宫内膜异位症组织中的表达显著低于对照组织中的表达(P<0.05)。2.选取 miR-138、miR-231、miR-177、miR-189、miR-241 以及 miR-412六种miRNAs进行qRT-PCR检测验证,与芯片检测结果一致,miR-13 8在子宫内膜异位症组织中的表达明显低于对照组织中的表达,差异具有统计学差异(P<0.05)。而 miR-231、miR-1 77、miR-1 89、miR-241 以及 miR-412在子宫内膜异位症组织以及对照组织中的表达无明显差异(P>0.05)。3.与对照组相比,子宫内膜异位症小鼠腹腔液中CD11b阳性细胞数量显著升高(P<0.05),这说明腹腔液中巨噬细胞增多。研究结论:MiR-138在子宫内膜异位症组织中低水平表达,在子宫内膜异位症的发生发展中可能具有调节作用,并且miR-138在子宫内膜异位症中的生物学作用可能与免疫炎症反应相关。第二部分 MicroRNA-138对子宫内膜细胞生物学行为及炎症反应的影响研究目的:探索miR-138在子宫内膜异位症中的细胞生物学功能以及与炎症相关因子表达的关系。研究对象:子宫内膜干细胞(Endometrial stem cells,ESCs)、人白血病单核细胞系THP-1。研究方法:采用子宫内膜干细胞ESCs和THP-1细胞共培养的方法构建子宫内膜异位症的体外细胞模型,模拟子宫内膜异位症的细胞生存环境及状态。登录 miRBase(http://www.mirbase.org/)miRNA 数据库,查询得到miR-138成熟体的序列全长,设计合成miR-138 mimics过表达模拟物和anti-miR-138抑制剂,通过细胞转染的方法构建miR-138过表达细胞模型和miR-138干扰细胞模型。利用MTT实验、LDH实验、细胞凋亡实验探索miR-138过表达或干扰对子宫内膜异位症细胞增殖、细胞毒性以及凋亡能力的影响;利用酶联免疫吸附测定实验(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)探索miR-138过表达或干扰对子宫内膜异位症细胞炎症相关因子表达的影响。研究结果:1.转染miR-138 mimics后,miR-138在细胞中的相对表达量显著上调(P<0.05),可以成功构建miR-1 38过表达的子宫内膜细胞模型;转染anti-miR-138后,miR-138在细胞中的相对表达量显著下调(P<0.05),可成功构建miR-138低表达的子宫内膜细胞模型。2.miR-138的上调抑制了子宫内膜细胞的增殖并提高了 LDH活性,且均具有统计学差异(P<0.05),miR-138的上调可明显促进子宫内膜细胞的凋亡,与凋亡相匹配,miR-138的上调可明显提高caspase-3和caspase-9的表达水平,且均具有统计学差异(P<0.05)。3.miR-138的下调促进了子宫内膜细胞的增殖并抑制了 LDH活性,且均具有统计学差异(P<0.05),miR-138的下调可明显抑制子宫内膜细胞的凋亡,与此同时,miR-138的下调可明显降低caspase-3和caspase-9的表达水平,且均具有统计学差异(P<0.05)。4.miR-138上调可显著抑制子宫内膜异位症细胞模型中炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6 以及 IL-18 的表达(P<0.05);反之,miR-138 的下调则能够促进子宫内膜异位症细胞模型中炎症反应因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18的表达(P<0.05)。研究结论:MiR-138可以显著抑制子宫内膜细胞的增殖,促进子宫内膜细胞的凋亡;并可调控子宫内膜异位症细胞模型中炎症相关因子的表达。由此推断,miR-138在子宫内膜异位症中对细胞增殖、凋亡及免疫炎症反应等具有重要调节作用。第三部分 MicroRNA-138对子宫内膜细胞生物学行为及炎症反应影响的分子调控机制研究目的:探索miR-138在子宫内膜异位症中的下游靶基因,研究miR-138在子宫内膜异位症细胞模型中发挥细胞功能可能的分子作用机制。研究对象:由子宫内膜干细胞(Endometrial stem cells,ESCs)和人白血病单核细胞系THP-1共同培养构建的子宫内膜异位症体外细胞模型。研究方法:利用生物信息学预测miR-138下游可能的靶基因。细胞免疫荧光实验验证miR-138对靶基因蛋白表达的调控作用。通过细胞转染的方法构建miR-138过表达细胞模型和miR-138干扰细胞模型。利用免疫印迹的方法(Western Blot)检测miR-138对Bax,NF-κB和VEGF蛋白表达的影响。利用NF-κB抑制剂及表达载体对NF-κB蛋白功能进行恢复,观察NF-κB对miR-138的回复作用。利用VEGF抑制剂及表达载体对VEGF蛋白功能进行恢复,观察VEGF对miR-138的回复作用。研究结果:1.生物信息学预测的方法发现miR-138可以靶向作用于p65基因mRNA的3’-非翻译区。细胞免疫荧光实验显示miR-138表达的上调可以明显抑制THP-1细胞中NF-κB P65蛋白亚型的表达。2.上调miR-138可以抑制NF-κB信号通路中Bax,NF-κB和VEGF蛋白表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05);下调miR-138的表达可以促进NF-κB信号通路中Bax,NF-κB和VEGF蛋白表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.单独上调miR-138可显著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18的表达,抑制子宫内膜细胞的增殖,促进细胞凋亡,且均具有统计学差异(P<0.05)。在上调miR-13 8表达的同时过表达NF-κB蛋白或VEGF蛋白,与单独上调miR-138相比,Bax、NF-κB和VEGF蛋白的表达抑制作用部分得到解除,TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18的表达显著上调,细胞的增殖和凋亡也得到一定程度的恢复,且均具有统计学差异(P<0.05)。4.单独下调miR-138可以显著促进TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18的表达,促进子宫内膜细胞的增殖,抑制细胞凋亡,且均具有统计学差异(P<0.05);下调miR-138表达的同时加入NF-κB抑制剂或VEGF抑制剂处理细胞,与单独下调miR-138相比,TNF-α IL-1β、IL-6以及IL-18的表达显著降低,细胞的增殖和凋亡得到一定程度的恢复,且均具有统计学差异(P<0.05)。研究结论:miR-138可以靶向作用于p65基因mRNA的3’-非翻译区,从而负向调控NF-κB P65蛋白亚型的表达。在子宫内膜异位症中miR-138可以通过NF-κB/VEGF信号通路对细胞的增殖、凋亡以及炎症反应产生作用。因此,miR-138在子宫内膜异位症中的发生发展具有重要调控作用。