目的探讨过表达的野生型第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten,PTEN)及其突变体G129E基因(无脂质磷酸酶活性而只具有蛋白磷酸酶活性)对体外培养的活化肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)/p130 Crk相关底物蛋白(p130 Crk-associated substrate,p130Cas)及桩蛋白(paxillin)信号转导的影响。方法利用腺病毒反复感染AD293的方法扩增实验所需的腺病毒(Ad-GFP、AdPTEN、Ad-G129E),分别测定三组病毒滴度;体外培养的活化大鼠HSC细胞系(HSC-T6株),通过腺病毒作为载体将靶向双重磷酸酶活性的野生型PTEN基因及其只具有蛋白磷酸酶活性的突变体G129E基因瞬时转染至活化HSC;采用Western blot检测活化HSC的PTEN、FAK、磷酸化FAK(Thr397)[phosphorylated FAK(Thr397),p-FAK(Tyr397)]、p130Cas、paxillin蛋白表达;实时荧光定量PCR技术测定活化HSC的PTEN、FAK、p130Cas、paxillin的m RNA表达。所有资料均应用Excel 2010建立数据库,采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间比较采用LSD检验,P<0.05即认为有统计学意义。实验分组如下:(1)Control组:腺病毒转染时以DMEM基础培养液代替腺病毒;(2)Ad-GFP组:转染表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的载体空病毒AdGFP;(3)Ad-PTEN组:转染携带野生型PTEN基因并表达GFP的重组腺病毒AdPTEN;(4)Ad-G129E组:转染携带G129E基因并表达GFP的重组腺病毒AdG129E。结果1通过腺病毒反复感染人胚肾细胞(AD293)的方法扩增实验所需的腺病毒,Ad-PTEN滴度为1.3×109pfu/m L、Ad-G129E滴度为1.4×109pfu/m L及Ad-GFP滴度为1.6×109pfu/m L。2 M.O.I.值为100时,腺病毒感染肝星状细胞后48h,计数GFP荧光阳性表达细胞细胞数,测得Ad-PTEN、Ad-G129E及Ad-GFP三组腺病毒感染率均>80%。3腺病毒转染后48h,应用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)检测各组HSC的PTEN m RNA表达,并采用2-△△Ct相对定量法比较,以Control组的PTEN m RNA表达量为1,相对于Control组Ad-GFP组PTEN m RNA表达倍数为1.03显著低于Ad-PTEN组的1.90及Ad-G129E组的1.83倍,Control、Ad-GFP两组之间及Ad-PTEN、Ad-G129E两组之间无显著差异(P>0.05)。Western blot技术检测各组HSC的PTEN蛋白表达:Ad-PTEN组(1.08±0.07)、Ad-G129E组(0.97±0.04)明显高于Control组(0.56±0.05)及Ad-GFP组(0.69±0.07),P<0.05;而Control组与Ad-GFP组及Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间均无显著差异(P>0.05)。4应用实时荧光定量PCR和Western blot技术方法检测腺病毒感染HSC48 h后各组HSC FAK m RNA及其蛋白表达,结果显示各组之间HSC的FAK m RNA及蛋白表达均无显著差异(P>0.05)。5腺病毒感染HSC 48h,应用Western blot分析各组HSC的pFAK(Tyr397)蛋白表达,Ad-PTEN组(0.437±0.039)、Ad-G129E组(0.456±0.042)明显低于Control组(0.701±0.028)及Ad-GFP组(0.694±0.019),P<0.05;Control、Ad-GFP两组之间及Ad-PTEN、Ad-G129E两组之间无显著差异(P>0.05)。6腺病毒转染后48h,应用实时荧光定量PCR技术检测各组HSC的p130Cas m RNA表达,以Control组的p130Cas m RNA表达量为1,相对于Control组Ad-GFP组P130cas m RNA表达倍数为1.001倍,AdPTEN组的0.589倍及Ad-G129E组的0.574倍显著低于Control组及Ad-GFP组(P<0.05),Control组、Ad-GFP组两组之间及Ad-PTEN组、Ad-G129E组两组之间无显著差异(P>0.05)。Western blot技术检测各组HSC p130Cas蛋白表达,Ad-PTEN组(0.596±0.041)、Ad-G129E组(0.534±0.049)明显低于Control组(1.137±0.193)及Ad-GFP组(1.036±0.116),差异有统计学意义(P<0.05);Control、Ad-GFP两组之间及Ad-PTEN、Ad-G129E两组之间无显著差异(P>0.05)。7腺病毒转染后48h,应用实时荧光定量PCR技术检测各组HSC的paxillin m RNA表达,以Control组的paxillin m RNA表达量为1,相对于Control组Ad-GFP组paxillin m RNA表达倍数为0.962倍,Ad-PTEN组的0.425倍及Ad-G129E组的0.437倍显著低于Control组及Ad-GFP组(P<0.05),Control、Ad-GFP两组之间及Ad-PTEN、Ad-G129E两组之间无显著差异(P>0.05)。Western blot技术检测各组HSC paxillin蛋白表达,Ad-PTEN组(0.595±0.054)、Ad-G129E组(0.667±0.036)明显低于Control组(1.328±0.193)及Ad-GFP组(1.270±0.114),差异有统计学意义(P<0.05);Control、Ad-GFP两组之间及Ad-PTEN、Ad-G129E两组之间无显著差异(P>0.05)。结论1过表达的野生型PTEN及其突变体G129E可显著抑制体外活化HSC的FAK/p130Cas、paxillin信号转导。2野生型PTEN及其突变体G129E对活化HSC FAK/p130Cas及paxillin信号转导的抑制作用无显著差异。3 PTEN主要通过其蛋白磷酸酶活性发挥对活化HSC的FAK/p130Cas及paxillin信号转导的抑制作用。