猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立

来源 :哈尔滨师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:aska1982st
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猪瘟病毒是导致猪瘟的主要原因,被世界动物组织列为必需上报的传染病之一[1]。猪瘟是一种传染性和死亡性价高的一种疾病,对国内外的养猪业造成巨大的威胁。猪瘟病毒是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员,细胞表面有囊膜,遗传物质为正链RNA病毒。猪瘟病毒与同属的其他病毒一样,猪瘟病的的基因组全长为12.5kb,含有一个大的开放阅读框架编码4000个氨基酸。这个大的开放阅读架编码着CSFV所有的结构蛋白C、Erns、E1、E2和非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B[2]。目前,使用的猪瘟兔化弱毒疫苗C株能够有效提高免疫从而减少猪瘟病的流行。但是正是由于C株疫苗的广泛使用,使得区分接种疫苗株和野毒感染株变得困难和重要。  先前已经报道过利用传统反转录PCR方法去区分鉴定猪瘟病毒野毒株与疫苗株。但是荧光定量PCR技术是一种快速、敏感、特异、高通量的方法所以更适合进行快速定量的进行检测,而关于应用荧光定量PCR技术鉴定区分猪瘟病毒的报告已经也有不少。如被报道的,利用TaqMan探针通过单个核苷酸的差别鉴定区分韩国猪瘟野生毒株和疫苗株的方法[3]。我国学者利用TaqMan探针根据5’UTR的差异,设计特异性引物对我国猪瘟病毒野生毒株与C株进行鉴定区分[4],但是SYBR Green I染料法不同于TaqMan探针法。TaqMan探针荧光定量PCR需要价格昂贵的探针,是根据探针碱基差别进行检测的,而SYBR Green I荧光定量PCR是利用非特异性的燃料结合双链DNA结构的[6]。  本实验建立了一种SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,根据E2蛋白基因的差别来区分鉴定猪瘟病毒野毒株与疫苗株。本方法具有很高的敏感性,结果显示在每个反应中最低能检测出10拷贝数/μL。通过9种病毒的特异性实验,结果显示本方法具有很好的特异性。  本研究是一种敏感、特异、有效的区分鉴定猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法,本实验所建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可以被广泛的应用在现地进行猪瘟病毒野毒株与疫苗株的区分鉴别。
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