前言支气管哮喘是由多种炎症细胞以及它们分泌的各种炎性因子参与的气道慢性炎症性疾病,伴有气道高反应、粘液高分泌及可逆性气流受限,晚期还可出现气道重塑。Th2占优势的Th1/Th2失衡被传统观念认为是哮喘发病的免疫学机制。Th2细胞导致嗜酸细胞性哮喘(Eosinophilic asthma, EA)的发病。临床上运用一线药物糖皮质激素和(或)p受体激动剂能够控制绝大多数嗜酸性粒细胞哮喘患者的症状和提高他们的生活质量。但部分患者却表现出糖皮质激素抵抗,这类患者多为中性粒细胞性哮喘,且病情严重,已成为临床研究的难点。因此这类患者的生理病理特点,疾病的发病机制,新的有效的治疗靶点和方法成为近年来哮喘领域的研究热点。近年来新发现的Th17细胞,能很好地解释"Th2理论”不能解释的一些实验和临床现象。Th17细胞能够分泌白细胞介素(interleukin-17,IL-17)。IL-17介导的信号途径可诱导靶细胞产生多种炎症因子刺激组织,能招募中性粒细胞在气道局部聚集并激活,导致组织浸润和组织损害。糖皮质激素不仅不能抑制中性粒细胞,反而能增加中性粒细胞的活性和生存周期。此外,IL-17还参与气道重塑。已有文献证实Th17/IL-17由与哮喘的严重程度成正相关。综上所述,进一步从分子水平探讨Th17/IL-17轴,尤其是该轴的上游,有望进一步了解哮喘的发病机制,为寻找新的治疗靶点提供理论依据。多巴胺受体可分为Dl类和D2类受体,多巴胺D1类受体与神经和精神疾患的关系已有大量的研究,多巴胺Dl类受体是治疗这些精神疾患的一个重要靶点。最近有研究发现多巴胺D1类受体还参与免疫疾病的发病机制。D1类受体拮抗剂可以抑制Th17和Th2细胞的分化,促进Th1细胞的分化,预防及治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)、治疗非肥胖的糖尿病(non-obesity diabetes, NOD)小鼠、能减少小鼠肾毒性血清肾炎(nephrotoxic serum nephritis, NTN)新月体的形成,能减轻类风湿性关节炎中的炎症反应,减少关节的损伤。因为Th2细胞和Th17细胞的过度活化及Th1细胞的抑制,参与哮喘的发病,所以,我们推测D1类受体可能通过影响Th17细胞而参与哮喘的发病。首先我们通过分别用D1受体拮抗剂、激动剂和生理盐水干预小鼠哮喘模型,观察各组小鼠的一般行为活动,检测肺功能,对支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)进行细胞分类计数及检测其IL-17的水平,观察肺病理切片、用流式细胞术(flow cytometry)检测脾脏CD4+T细胞中Th17细胞的比例,用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测脾CD4+T细胞培养液上清液中IL-17的水平。通过这些指标来观察Dl受体拮抗剂和激动剂对哮喘小鼠的影响及在体内对Th17/IL-17轴的影响。我们进一步探讨D1类受体影响Th17细胞可能的信号通路。Nakagome K等认为可能是D1类受体激动后增加初始CD4+T细胞内cAMP的浓度,促进Th17细胞的分化。此外,D1类受体影响DC分泌IL-23可能亦是其影响Th17细胞途径之一。但环腺苷酸(cyclicadenosine monophosphate, cAMP)为什么能促进初始CD4+T细胞向Th17细胞分化?目前无相关报道。本实验将探讨cAMP促进初始CD4+T细胞向Th17细胞分化的信号通路。D1类受体属于G蛋白耦联受体(G-protein coupled receptor, GPCR),它介导经典信号通路Gs/AC/cAMP通路。Zhen等发现激动D1受体可增加胞内cAMP的浓度,进而激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)。 p38MAPK是细胞内信息传递的交汇点和共同通路,可激活核转录因子kB(nuclear factor-kappa b, NF-kB)。 NF-kB是一种普遍存在的转录调节因子,可控制BATF基因的转录。BATF (B cell activating transcription factor)是近期发现的AP-1(activator protein1)家族新成员。BATF是Th17细胞不可缺少的一个核转录因子,它参与RORα和RORyt表达的维持,并且通过直接结合在IL-17基因的启动子上,和ROγt协同诱导IL-17的表达。基于上述,我们大胆推测,D1类受体可通过调控BATF促进Th17细胞的分化。本研究将在体外探讨D1类受体是否通过调控BATF促进Th17细胞的分化。首先分离、纯化正常小鼠脾源性CD4+T细胞并予Th17细胞定向分化的环境,同时分别用D1类受体拮抗剂和激动剂干预。定向分化3天后,用流式细胞术检测Th17细胞的比例,ELISA检测培养液上清中IL-17的浓度,免疫蛋白印迹(western blot, WB)检测RORyt和BATF的表达。探讨了D1类受体对Th17细胞分化及对BATF表达的影响后,用BATF小干扰RNA (short interfering RNA,siRNA)和对照siRNA(即无干扰效果的siRNA)转染两组小鼠脾CD4+T细胞,再予Th17细胞定向分化的坏境,同时加入D1类受体激动剂。培养分化细胞后,用WB检测BATF的表达,评估用siRNA转染细胞后,BATF的沉默效果。在检测到BATF的沉默效果佳后,用流式细胞术检测Th17细胞的比例,WB检测RORγt的表达,ELISA检测培养液上清中IL-17的浓度,观察D1类受体激活后,BATF基因部分沉默和正常表达时Thl7细胞的分化情况,以期阐明D1类受体影响Th17细胞分化的信号通路。第一章多巴胺D1类受体对急性哮喘气道炎症及Th17/IL-17轴的影响目的(1)建立急性哮喘小鼠模型,并鉴定建立的模型是否成功；(2)观察D1类受体拮抗剂和激动剂对急性哮喘小鼠气道炎症及Th17/IL-17轴的影响。方法将24只SPF级BABL/c雌性小鼠随机分为四组：正常对照组(CK)、哮喘组(AS)、D1类受体拮抗剂SCH23390干预哮喘组(SCH干预组)和D1类受体激动剂SKF83959干预哮喘组(SKF干预组)各6只。用OVA致敏、激发建立急性哮喘模型,正常对照组以等体积的PBS代替OVA致敏、激发,SCH干预组和SKF干预组每次雾化前30min均予腹腔注射相应的试剂,末次激发24h后处理所有小鼠：(1)对小鼠的一般行为活动进行观察；(2)收集BALF行细胞计数、分类,检测BALF中IL-17的浓度；(3)肺组织病理切片观察炎症细胞浸润及黏液分泌；(4)研磨各组.小鼠脾脏,制备单个核细胞悬液,MACS技术分离脾脏CD4+T细胞,计算脾源性CD4+T细胞总数,判断细胞活力；(5)测定脾源性CD4+T细胞中Th17细胞的比例及其培养液上清中IL-17的浓度；(6)乙酰甲胆碱激发小鼠后,有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性。结果(1)正常组小鼠表现正常,哮喘组小鼠出现典型的哮喘样症状,SCH干预组小鼠症状明显减轻;而SKF干预组小鼠症状有所加重；(2)与正常组相比,哮喘组BALF中白细胞总数、Lym、Neu、Eos数量及IL-17的浓度均显著增加(均P<0.05);SCH干预组白细胞总数、Eos、Lym、Neu数量及IL-17的浓度均较哮喘组有所降低(P<0.05)；而SKF干预组白细胞总数、Eos、Lym、Neu数量及IL-17的浓度均较哮喘组有所增加(P<0.05)；(3)与正常组相比,哮喘组小鼠肺部大量炎症细胞浸润、杯状细胞增生、气道分泌大量黏液(P<0.05)；SCH干预组气道炎症和黏液高分泌状态较哮喘组有所缓解(P<0.05)；而SKF干预组气道炎症和黏液高分泌状态较哮喘组加重(P<0.05)；(4)与正常组相比,哮喘组小鼠脾脏中CD4+T细胞数量明显增多(P<0.01)；与哮喘组相比,SCH干预组脾脏CD4+T细胞数量均明显减少(P<0.01)；与哮喘组相比,SKF干预组脾脏CD4+T细胞数量均明显增加(P<0.01)；(5)与正常组相比,哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中Th17细胞比例及其培养液上清中IL-17的浓度显著增加(P<0.01)；SCH干预组Th17细胞比例及其培养液上清中IL-17的浓度较哮喘组有所降低(P<0.01)；而SKF干预组Th17细胞比例及其培养液上清中IL-17的浓度较哮喘组有所降低(P<0.01)；(6)与正常组相比,哮喘组气道反应性显著增高(P<0.05)；与哮喘组相比,SCH干预组小鼠气道反应性有所降低(P<0.05),而SKF干预组气道反应性有所升高(P<0.05)。结论(1)本实验中建立的急性哮喘小鼠模型是成功的,Th17/IL-17轴参与了哮喘的发病；(2)D1类受体参与了哮喘的发病,对Th17/IL-17轴的调节是其中的一个机制。第二章多巴胺D1类受体调控BATF促进Th17细胞的分化目的(1)探讨在体外D1类受体对Th17细胞分化的影响及D1类受体对BATF表达的影响；(2)证实D1类受体通过调控BATF促进Th17细胞的分化。方法体外实验分两部分：第一部分将MACS分离纯化获得的正常小鼠脾CD4+T细胞分成三组：原液对照组、D1类受体拮抗齐SCH23390干预组和D1类受体激动剂SKF83959干预组。每组予Thl7细胞定向分化的环境,并予相应的试剂干预。培养分化细胞后,分别用流式细胞术检测Th17细胞的比例,ELISA检测培养液上清中IL-17的浓度,WB检钡RORγt和BATF的表达。第二部分将正常小鼠脾CD4+T细胞分成两组：BATF-siRNA组和对照siRNA组。首先我们分别用可以沉默BATF表达的BATF siRNA和对照siRNA(即无干扰效果的siRNA)转染两组小鼠脾CD4+T细胞,再予Th17细胞定向分化的环境,同时加入D1类受体激动齐SKF83959。培养分化细胞后,用WB检钡JBATF的表达,评估用siRNA转染细胞后,BATF的沉默效果。在检测至BATF的沉默效果佳后,用流式细胞术检测Th17细胞的比例,WB检测RORγt勺表达,ELISA检测培养液上清中IL-17的浓度,观察D1类受体激活后,BATF基因部分沉默和正常表达时Th17细胞的分化情况。结果(1)与原液对照组相比,SCH23390干预组Th17细胞所占的比例明显下降(P<0.01),而SKF83959干预组Th17细胞所占的比例有所升高(P<0.01)；(2)与原液对照组相比,SCH23390干预组培养液上清中IL-17的浓度明显下降(P<0.01),而SKF83959干预组培养液上清中IL-17的浓度明显升高(P<0.01)；(3)与原液对照组相比,SCH23390干预组RORyt的表达明显下降(P<0.01),而SKF83959干预组RORyt的表达明显升高(P<0.01)；(4)与原液对照组相比,SCH23390干预组BATF的表达明显下降(P<0.01),而SKF83959干预组BATF的表达明显升高(P<0.01)；(5) BATF-siRNA组BATF的表达比对照siRNA组明显下降(P<0.01);(6) BATF-siRNA组Th17细胞所占的比例比对照siRNA组明显下降(P<0.01)；(7) BATF-siRNA组RORyt的表达比对照siRNA组明显下降(P<0.01);(8) BATF-siRNA组培养液上清中IL-17的浓度比对照siRNA组明显下降(P<0.01)。结论(1)在体外D1类受体可调控Th17细胞的分化和BATF的表达；(2)D1类受体可调控BATF促进Th17细胞分化。