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迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种革兰氏阴性致病菌,可感染多种宿主,尤其是鱼类,长期以来是最为严重的鱼类病原菌之一。研究表明,E.tarda能在宿主吞噬细胞如巨噬细胞中增殖,也能够抵抗宿主血清的免疫杀伤,然而这些现象的内在机制不清楚。本论文的目的是研究E.tarda在巨噬细胞内的侵染途径,探索E.tarda与宿主(半滑舌鳎,Cynoglossus semilaevis)补体调节因子CD59(CsCD59)的相互作用,从而促进我们对E.tarda逃逸宿主细胞免疫杀伤和补体免疫杀伤机制的理解。为了研究E.tarda的胞内侵染途径,我们首先验证了本实验室分离的鱼类致病菌E.tarda TX1可侵染小鼠巨噬细胞系RAW264.7并在其中增殖。利用不同内吞途径的抑制剂处理和RNA干扰技术(RNAi),发现抑制网格蛋白(Clathrin)和小窝蛋白(Caveolin)介导的内吞途径能显著地降低E.tarda的入侵,而抑制巨胞饮途径却对E.tarda入侵没有影响;通过免疫荧光实验,发现E.tarda能与Clathrin和Caveolin发生共定位,其比例分别为23.6%和20.4%;抑制Clathrin和Caveolin介导的内吞途径后,RAW264.7对灭活和非灭活E.tarda的相对摄入率都会明显降低,说明这两条内吞途径对E.tarda进入巨噬细胞并非是特异的。内吞体酸化抑制剂处理细胞后,E.tarda的入侵明显降低;免疫荧光显微镜观察发现活E.tarda都可与前期内体(Early endosome)、晚期内体(Late endosome)及内体溶酶体(Endolysosomes)的标志蛋白Rab5、Lamp1和Cathepsin D共定位,其比例分比为29.6%、28.7%和36.7%;Lyso-tracker染色显示E.tarda存在于酸性细胞器中。灭活E.tarda也具有相似的共定位现象。这些结果说明E.tarda进入胞内后会经历前期内体、后期内体及内体溶酶体途径。此外,抑制微丝(Microfilament)和微管(Microtubule)会显著降低E.tarda的入侵,并且E.tarda能够与微丝和微管共定位,说明E.tarda进入巨噬细胞的过程是依赖于细胞骨架的。总而言之,本论文结果首次揭示了E.tarda极有可能是以一种被动和不依赖毒力的方式进入细胞,这种方式依赖于Clathrin-和Caveolin-介导的内吞途径及细胞骨架。补体系统是免疫系统中不可缺少的一部分,由多种蛋白组成。其中,CD59是补体系统的一种调节因子,可抑制补体系统膜攻击复合物的形成,保护自身细胞不被补体伤害。为研究E.tarda是否可以利用CD59来逃逸鱼类补体系统杀伤,我们首先对CsCD59进行基因克隆和蛋白表达纯化。序列比对发现CsCD59由107个氨基酸组成,具有保守的CD59结构特征,与已知鱼类CD59氨基酸序列相同度介于33%-46%之间。qRT-PCR检测发现在正常生理条件下,CsCD59在多个组织中表达,在肝脏中表达水平最高,在血中表达量最低;E.tarda等病原菌刺激后,肝脏、脾脏和肾脏中CsCD59的表达水平显著上调。兔血红细胞溶解实验证实重组CsCD59(rCsCD59)能显著地抑制半滑舌鳎补体系统的激活。ELISA和免疫荧光显微镜观察发现rCsCD59能结合E.tarda等革兰氏阴性菌以及Bacillus subtilis等革兰氏阳性菌。这种结合作用对细菌本身存活没有影响,但能显著地提高E.tarda等细菌在半滑舌鳎血清中的存活率。这些结果显示鱼类CD59能促进E.tarda等细菌逃逸补体介导的杀伤作用,E.tarda很可能通过上调CD59的表达并与CD59相互作用而得以在血清中存活。