论文部分内容阅读
研究背景：肝脏作为人体内最大的器官,构成体重的2.5%。肝脏的血液供应占全部血液循环的25%,分别通过门静脉和肝动脉流入肝门,其中前者贡献了肝脏全部血供的75-80%和全部氧供的>50%。热缺血再灌注损伤是临床中非常常见的急性肝损伤,肝脏手术中经常应用的Pringle manoeuvre是造成热缺血再灌注损伤的主要原因。目前研究发现,肝脏缺血再灌注损伤受到众多调控机制的共同作用,包括血窦内皮细胞和NO共同介导的血窦内压力改变、Kupffer细胞介导的固有免疫反应[2,3]以及ATP耗竭介导的肝细胞坏死和caspase介导的细胞凋亡等。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在调控细胞凋亡、自噬、生长和再生及蛋白质合成方面发挥重要调控作用,已有研究发现PI3K/Akt激活的下游凋亡和自噬通路调控肝脏缺血再灌注[8],同时也有研究发现Rapamycin抑制nTORCl功能从而激活mTORC2-Akt通路从而减轻肝脏缺血再灌注损伤。Wip1 (Wild-type p53 induced phosphatase 1)是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,研究发现其在机体免疫调控看、炎症发生过程中发挥作用,但目前尚无研究报道Wipl在肝脏缺血再灌注过程中的作用。本研究利用2/3肝脏热缺血再灌注模型研究wip1基因在急性肝损伤中的作用,并初步探索Wip1对于肝脏缺血再灌注影响的机制。研究方法：1.将129sv背景的wip1基因敲除小鼠和C57BL/6背景的野生型小鼠进行杂交,以获得C57BL/6纯合背景的wip1基因杂合小鼠,并进一步获得wip1基因敲除小鼠。2.10～14周龄wip1基因敲除小鼠作为实验组小鼠,同窝同性别小鼠作为对照组小鼠,建立2/3肝脏热缺血再灌注模型,缺血时间为60min、90min,术后6h、24h提取小鼠血液和肝脏,测血清ALT水平,H&E染色观察组织学改变,TUNEL染色统计细胞凋亡率,Western Blot检测肝组织Wip1、Akt、mTOR、p70 S6K、S6蛋白及相应磷酸化水平的改变,RT & Real-time PCR检测肝组织wipl基因转录水平的改变。结果：1.缺血60min,再灌注6h后,小鼠血清ALT水平分别为：野生型小鼠1172.5±237.1U/L,wipl-/-小鼠851.3±270.9U/L(P<0.01):假手术组小鼠ALT水平分别为：野生型小鼠44.3±11.3U/L,wip1-/-小鼠56.6±12.9U/L(p=0.369).与同窝对照野生型小鼠相比,wipl基因敲除小鼠肝脏损伤轻。2.缺血90min,再灌注24h后,小鼠肝组织石蜡切片H&E染色结果为：野生型小鼠Suzuki评分为7.75±0.43,wip1-/-小鼠为5.25±0.43(P<0.01)。与同窝对照野生型小鼠相比,wip1基因敲除小鼠组织病理学改变轻。3.缺血90min,再灌注24h后,小鼠肝组织石蜡切片TUNEL染色结果为：野生型小鼠凋亡率约为62.3%±5.6%,wipl-/-小鼠约为30.4%±3.7%(P<0.01)。与同窝对照野生型小鼠相比,wip1基因敲除小鼠凋亡率低。4.缺血90min,再灌注6h后,野生型小鼠肝组织Wip1蛋白表达量有所下降；与同窝对照野生型小鼠相比,wip1-/-小鼠肝组织mTOR.phosph0-mTOR(Ser2448).Akt、S6蛋白水平无显著差异,phospho-Akt(Ser473).phospho-p70S6K(Thr389)蛋白水平明显升高,phospho-S6(Ser235/236)蛋白水平有所升高,phospho-mTOR(Ser2481)蛋白水平较损伤前有所下降。结论：wip1基因敲除后肝脏缺血再灌注损伤减轻,可能与Wip1敲除后促进P13K/Akt/mTOR通路进一步激活,并通过下游蛋白对细胞凋亡的调控完成。