乳腺癌是全球女性癌变诊断率最高的癌症之一,由于其高转移活性以及转移后高达90%的死亡率而备受人们关注。无序生长和高迁移运动活性是转移性乳腺癌细胞的重要特征,这两个过程都涉及到细胞肌动蛋白骨架的解聚与重排。很多研究已证明肌动蛋白的解聚、重排在细胞许多生理活动的控制中起关键作用,包括:细胞分裂、迁移、内吞和外排作用、凋亡和炎症、囊泡运输和基因表达。为数众多肌动蛋白结合蛋白(acin binding protein, ABPs)在调节细胞骨架的解聚、重排中起了重要作用,其中就包括存在于几乎所有脊椎动物细胞中的钙调蛋白结合蛋白(Caldesmon,CaD)。CaD有由同一基因通过选择剪接产生的两种亚型:平滑肌型(h-caldesmon, h-CaD)和普遍存在的非肌型轻链CaD (l-caldesmon, l-CaD)。一般认为h-CaD是平滑肌细胞中收缩结构的完整组件,l-CaD是细胞骨架单位。大量研究证明了l-CaD通过对细胞骨架的作用调节诸如上皮细胞、内皮细胞以及成纤维细胞等正常细胞迁移运动活性,而对于l-CaD对细胞骨架调整及其活跃的转移性乳腺癌细胞的影响,研究涉及甚少,对于l-CaD如何参与调节转移性乳腺癌细胞的迁移运动活性更是不得而知。在众多非转移性癌细胞以及永生化细胞系中,l-CaD的表达量很低,但在高迁移活性的转移性乳腺癌细胞中,l-CaD表达量显著上升,因此我们猜测l-CaD可能是维持转移性癌细胞高迁移能力的重要因素。为揭示了l-CaD对乳腺癌细胞迁移运动活性的影响极其调节机制,并为进一步认识转移性乳腺癌本质提供了新的思路,本研究以高转移活性的人源上皮型乳腺癌细胞MD MB-231作为实验载体,首先,通过构建肌动蛋白聚合阵列探讨了l-CaD对肌动蛋白聚合过程的影响;其次,在细胞层次上通过siRNA抑制MD MB-231细胞内l-CaD表达量和基因转染高表达外源l-CaD及其磷酸化突变株相结合方法,探索l-CaD对转移性乳腺癌细胞运动迁移活性的影响;最后,我们将体外构建的模拟l-CaD磷酸化封闭多肽导入细胞内并通过裸鼠模型,进一步检测l-CaD对转移性乳腺癌细胞运动迁移活性以及在体肿瘤形成能力的影响。我们的主要研究内容包括:①体外蛋白层次上,利用荧光标记的G-actin,在F-actin缓冲体系中,不同时间位点分别加入涵盖了l-CaD主要肌动蛋白结合位点的C-端功能片段H32K,检测G-actin聚合形成F-actin的动力学过程。结果显示,H32K能够迅速与肌动蛋白结合,并对肌动蛋白的聚合过程有双重调节作用:在肌动蛋白聚合初期,H32K将抑制成熟肌动蛋白纤维的形成;在肌动蛋白聚合过程中,H32K将促进成熟肌动蛋白纤维的形成。磷酸化H32K跟肌动蛋白有一定的结合能力,但对肌动蛋白的聚合过程无显著影响。②细胞层次上, western-blotting检测人源转移性乳腺癌细胞MDA MB-231、人源非转移性乳腺癌细胞MCF-7以及正常人源上皮细胞HMEC的内源性l-CaD表达量及其磷酸化程度。结果显示,内源性l-CaD在MDA MB-231细胞中表达量较高,其表达水平与HMEC细胞相当,而MCF-7的l-CaD表达量显著低于MDA MB-231细胞。除此之外,MDA MB-231细胞内源性l-CaD磷酸化水平显著高于HMEC细胞。l-CaD在转移性乳腺癌细胞中的高表达以及显著高于正常细胞的磷酸化水平,可能是转移性乳腺癌细胞高侵袭表象的一个重要因素。③利用siRNA慢病毒载体感染MDA MB-231细胞,抑制胞内l-CaD表达,首先,通过western-blotting,检测l-CaD基因沉默的效率;其次,通过rhodamine phalloidin染色细胞骨架,考察l-CaD表达沉默后细胞骨架结构,再次,通过Transwell检测细胞的迁移运动能力,最后通过Traction force、Cell adhesion assay进一步检测细胞迁移过程中细胞基底牵张力与粘附能力。结果显示l-CaD表达沉默将导致细胞失去完整的细胞骨架结构,胞内应力纤维结构消失,细胞的迁移运动活性显著下降,细胞迁移过程中的细胞基底牵张力与粘附能力亦显著下调。④利用野生型l-CaD表达质粒以及模拟PAK和ERK磷酸化位点完全被封闭的l-CaD突变株A1234和模拟PAK和ERK位点完全磷酸化的突变株D1234作为“分子探针”来干扰或阻断胞内l-CaD磷酸化进程。通过western-blotting,检测外源l-CaD质粒的表达效率,考察高表达外源l-CaD细胞的骨架结构,检测细胞的迁移运动活性以及细胞基底牵张力与粘附能力。结果显示,wtCaD与A1234转染的细胞,细胞骨架显著增强,细胞收缩与粘附能力明显上调,但细胞整体迁移运动能力明显受到抑制;D1234对细胞骨架结构无显著影响,但明显抑制了转移性乳腺癌细胞的迁移运动能力,对非转移性乳腺癌细胞的影响不显著。⑤体外合成模拟具有肌动蛋白结合能力的l-CaD在PAK与ERK位点磷酸化封闭的多肽,并导入MDA MB-231细胞内,检测细胞骨架结构变化,考察细胞的增殖和迁移运动活性,通过裸鼠肿瘤形成模型,检测多肽导入后的MDA MB-231在体肿瘤形成能力。结果显示,合成的l-CaD的PAK与ERK位点不可磷酸化突变多肽能够显著抑制MDA MB-231细胞的增殖和迁移运动活性,降低其在体的肿瘤形成能力。综合以上结论我们推测,l-CaD主要通过介导细胞骨架结构影响转移性乳腺癌细胞迁移运动活性,l-CaD在转移性乳腺癌细胞内的高表达量和高效的磷酸化-去磷酸化循环可能是维持转移性乳腺癌细胞高迁移活性的关键因素,抑制l-CaD在胞内的表达或干扰其胞内磷酸化循环都将显著抑制转移性乳腺癌细胞的迁移运动活性;我们合成的模拟非磷酸化l-CaD功能片段的多肽对转移性乳腺癌细胞在体肿瘤形成能力的显著影响为l-CaD的磷酸化突变株在乳腺癌的临床治疗中的可能性应用打下了新的实验性基础。