牙本质非胶原蛋白(NCPs)在牙齿矿化过程中的作用一直是牙髓生物学的研究热点。应用组织学、生物化学和分子生物学等技术，从细胞水平、蛋白水平以至分子水平，已对其进行了大量的研究，使我们对牙本质矿化的过程和机理有了深入的理解。但目前的研究多集中于牙本质特异性蛋白，而对矿化组织特异性蛋白的研究相对较少。至于矿化组织特异性蛋白的确切生物学功能；它们之间以及它们与其他非胶原蛋白之间的相互作用；其在牙齿发育和骨组织发育中的作用：它们如何调节矿化过程，与牙本质发育不全症的关系等难题，仍有待我们作进一步深入研究。 牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1 DMP1)是矿化组织特异性蛋白的重要成员之一，它富含天门冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸，是一种分泌性磷酸化蛋白，与BAG-75有高度同源性，与骨桥素有部分同源性，它的组成介于骨酸性糖蛋白和牙齿磷酸化蛋白之间。研究表明：过表达DMP1基因的未分化间充质细胞可向成牙本质细胞样细胞分化，并可以使其在分化的早期阶段表达ALP、Cbfa1、BMP4，在分化的末期阶段表达BSP、OCN、OPN。而且随着DMP1表达量的增加，DMP2和DSP的表达量也增加。而用酪蛋白激酶Ⅱ抑制剂阻断DMP1磷酸化，DMP2、DSP、Cbfa1、OCN的表达未见明显变化。同时，过表达DMP1 京回军巨大攀双士学位论文 基因的成牙本质样细胞可以促进细胞内矿化小结的形成和增大。由此可推测， 体内 DMP在未分化间充质细胞向成牙本质细胞分化以及骨和牙齿硬组织形成 过程中起着非常重要的作用。 目前关于 DMP的研究集中于分子生物学结构和功能。由于缺乏良好的工 召 具，其在蛋白水平的表达和功能研究较少。为获得良好的研究工具，以揭示 DMPI蛋白在组织矿化过程中所起的作用，本实验组制备了抗大鼠DMPI的单克 隆抗体，并初步观察其生物学功能。 主要研究内容及结果如下： 一．大鼠牙本质基质蛋白1对体外培养的人牙髓细胞增殖和碱性磷酸酶活性 的影响 利用MTT法研究牙髓细胞的细胞增殖情况，并研究DMPI对牙髓细胞内碱性 磷酸酶活性的影响。DMPI的浓度为0．05ty／ml、0．fly／ml、0．sug／ml、互W／ml 和5％／ml。MTT实验刺激时间分别为id、3d、sd，结果显示：id组与对照组比 较无明显差异；3d和sd的sty砌组可促进人牙髓细胞增殖（P＜0．05），3d和 sd的其它各浓度组则与对照组无明显差异（P＞0．05）。ALP活性测定刺激时间 分别为3d、sd、7d，结果显示：细胞培养3d时，仅SPg砌1组可促进人牙髓细 胞从P活性（P（．05）；培养sd时fly／ml和sty／。l均可促进人牙髓细胞队P活 性（K0．05）；培养7d时促进作用进一步加强（k0．05）；sd组和7d组之间 无明显差异（P＞0．05）。结果提示：DMPI对牙髓细胞ALP活性的促进作用呈浓 度依赖性；高浓度DMP可以促进人牙髓细胞ALP活性，随着时间的延长，促进 ALP活性的作用也增强。由此表明DMPI在一定浓度下可促进牙髓细胞的增殖和 分化。 二．抗大鼠DMPI单克隆抗体的制备和鉴定 以大鼠重组DMP为抗原，免疫Balb／c ，J’鼠，通过B淋巴细胞杂交瘤技术， 即用B淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2／0进行细胞融合，利用间接ELISA法筛选 D ePeParo刃ent Of OPeOPerat。Dent。卿andblaoaontics 厂力山YU 3 章旧罩区大学呵士学位论文 阳性克隆，制备抗大鼠 DMP的单克隆抗体（MCAB），并对其性质进行鉴定。 结果：共获得2株单克隆抗体细胞株。dot hi。t结果显示2株抗体均与DMPI 和牙齿组织总蛋白能够反应，而与脑组织、肝脏、肾脏组织总蛋白无反应， 说明2株抗体均具有较好的特异性。从亲和常数可知ZH10的亲和力大于2C10 的亲和力。本实验首次获得了特异性较好、效价较高的大鼠 DMP单克隆抗体，4 为进一步研究DMPI的确切生理功能提供了良好的工具。 三．牙本质基质蛋白l在大鼠不同组织中的表达研究 选用处于不同发育时期SD大鼠牙胚和牙齿；不同发育时期成年鼠的股骨 以及成年大鼠肝脏、肾脏和脑组织。采用免疫组织化学的方法，对 DMP在大 鼠不同组织中的表达进行研究。结果显示：D惭 在出生后3d大鼠磨牙和切牙 （牙本质基质分泌期）的成牙本质细胞胞浆顶端阳性表达，表明 DMP可能以 分泌颗粒的形式集聚于成牙本质细胞胞浆顶端，最终沿成牙本质细胞突分泌