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目的DNA损伤反应对肿瘤细胞启动化疗抵抗具有一定的作用。我们前期研究发现,耐药细胞EPI-R的DNA损伤修复活性被抑制后,可提高乳腺癌表柔比星耐药细胞对表柔比星的敏感性。本实验进一步研究循环肿瘤细胞(CTCs)与原位肿瘤细胞(PTCs)对表柔比星等化疗药物的敏感性是否存在差异,以及DNA损伤修复在循环肿瘤细胞化疗抵抗中的影响作用。方法1.4T1乳腺癌原位种植瘤动物模型建立及循环肿瘤细胞(CTCs)分离和鉴定:建立4T1乳腺癌模型;使用密度梯度离心法从小鼠血液中捕获CTCs;免疫细胞化学染色法检测从血液中分离细胞的CK表达水平,以鉴定循环肿瘤细胞。2.药物敏感性实验:(1)通过MTT细胞增殖实验、克隆球形成实验检测CTCs和PTCs对表柔比星、顺铂、紫杉醇的药物敏感性;(2)体内药物敏感实验中,通过比较表柔比星对CTCs和PTCs原位种植瘤的增殖抑制率,比较两种细胞对表柔比星的敏感性。3.DNA损伤修复检测:表柔比星处理CTCs和PTCs后,(1)Western blot检测两种细胞DNA损伤蛋白γH2AX和DNA损伤修复蛋白ATM、CHK2表达水平;(2)彗星实验检测表柔比星处理后两种细胞DNA的损伤水平。结果1.成功建立4T1乳腺癌原位种植瘤动物模型:荷瘤一周后在小鼠第四对脂肪垫可见5×5(mm)大小的结节,五周后剥离对其进行HE染色确定为肿瘤组织。2.CTCs分离和鉴定:通过密度梯度离心法分离出的肿瘤细胞,经免疫细胞化学染色法检测CK表达为阳性,证实循环肿瘤细胞来源于4T1细胞。3.药物敏感实验结果:(1)体外实验中CTCs对于表柔比星以及顺铂的药物敏感程度明显低于PTCs(P<0.05),CTCs与PTCs对于紫杉醇的药物敏感度无明显差异(P>0.05);(2)体内实验中表柔比星对于CTCs组原位种植瘤的增殖抑制率明显低于PTCs组(P<0.05)。4.DNA损伤水平检测:表柔比星作用后CTCs的DNA损伤蛋白γH2AX表达水平明显低于PTCs(P<0.05);彗星实验CTCs慧尾长度明显低于PTCs(P<0.05)。5.DNA修复水平检测:表柔比星作用后CTCs DNA损伤修复蛋白ATM,CHK2表达明显高于PTCs(P<0.05);ATM抑制剂KU55933作用于CTCs后经表柔比星处理,DNA损伤蛋白γH2AX明显增加(P<0.05),慧尾长度明显增加(P<0.05),对表柔比星敏感度明显增加(P<0.05)。结论从4T1乳腺癌小鼠血液中捕获的循环肿瘤细胞对表柔比星及顺铂的敏感性降低,其对表柔比星产生的耐药性可能与循环肿瘤细胞DNA损伤修复增加有关。