黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫层析电化学分析方法的建立

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黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreen mottle mosaic virus,CGMMV)严重危害黄瓜、西瓜、瓠瓜、甜瓜等葫芦科作物,且该病毒会导致作物大幅度减产。近年来,我国各口岸检验检疫部门多次在进境种子中检测出CGMMV。感染CGMMV的植株因环境条件、株系类别、寄主植物的不同,发病时表现的症状也有所差异,一般情况下会导致植株生长迟缓、矮化,叶片斑驳畸形,果肉纤维化甚至腐烂。针对CGMMV建立更为灵敏、快速、高效的检测方法十分必要。本论文以CGMMV为研究对象,利用实验室已有的具有高亲和力及特异性的单克隆抗体,对双抗夹心的免疫层析试纸条检测方法进行优化,并建立了免疫层析电化学分析方法,实现对CGMMV的特异性快速检测。主要内容包括以下方面:(1)免疫层析试纸条检测方法的优化:对本实验室前期制备保存的能稳定分泌抗CGMMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行复苏及传代培养,制备并收集腹水,利用亲和层析柱对抗体进行纯化,为后续相关检测方法的优化和建立提供材料。将单克隆抗体4D4作为识别抗体,用胶体金对其进行标记,将单克隆抗体2C9作为捕获抗体,同时为了提高免疫层析试纸条的稳定性,对试纸条参数及工作条件进行优化,改进并完善已有的CGMMV免疫层析试纸条检测方法。优化后的试纸条在常温条件下真空密封保存152天后仍能有效应用于CGMMV检测,具有良好的稳定性。经定性检测确定试纸条对该病毒的检测限稀释倍数为6400倍,且与烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)无交叉反应,实现了对CGMMV的快速、特异性检测。(2)免疫层析电化学分析方法的建立:该方法是将免疫层析试纸条与电化学检测技术相结合的一种快速检测技术。在本章研究中利用抗CGMMV单克隆抗体4D4和HRP标记纳米金,合成能明显放大检测信号的双重标记的纳米探针(McAb-HRP-AuNPs),同时对免疫层析电化学检测技术的实验参数和工作条件进行了优化,且在最优工作条件下对CGMMV的最低检测限稀释倍数可达到9600倍。免疫层析电化学生物传感器技术结合了免疫层析试纸条的快速和电化学检测技术的高灵敏度、低能源要求、检测结果直观易分析、便携易操作等优点,针对CGMMV初步构建出一种快速高效的新型检测方法,为将来能开发出更优良的检测技术提供思路。
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