酸敏感离子通道1a（acid-sensing ion channels 1a,ASIC1a）是一类能被胞外H⁺所激活的阳离子通道,通道的开放让胞外的钙离子内流,使得细胞内钙离子稳态发生改变,从而引起一系列的生理病理现象。有研究表明PI3K/AKT信号通路参与调节ASIC1a的表达和活化。内质网是重要的Ca²⁺储存站并参与胞质内Ca²⁺信号的调节,在信号通路中起着重要作用。钙离子紊乱会影响内质网蛋白质的合成和折叠功能,包括对蛋白的翻译修饰,从而诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）的发生和激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。UPR可以在短时间和较轻的内质网应激刺激下提高细胞的存活率,严重的内质网应激可以通过激活下游细胞凋亡信号分子诱导细胞凋亡。UPR主要有三条通路:蛋白激酶RNA样内质网激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK）,激活转录因子6（activating transcription factor 6,ATF6）,肌醇需求酶-1（inositol-requiring 1α,IRE1）。肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是对多次肝脏损伤的自我创伤修复的反应,其机制非常复杂,包括自我适应、炎症反应以及细胞凋亡。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是肝脏的主要纤维生成细胞,可被多种细胞因子激活,产生大量的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）胞内沉积。众多研究表明,ERS可以促进HSC的活化增殖,参与HF的发生发展。课题组前期研究结果发现:ASIC1a和ERS均参与HF的形成,特别是HSC的激活,但二者是否有潜在的相互作用机制尚不清楚。ASIC1a通路的激活使得细胞外钙离子内流,这是否会导致HFHSC内ERS的表达,从而加重HF?为此,本实验在课题组前期研究基础上,从动物模型及HF病人肝组织标本中检测ASIC1a和ERS相关蛋白的表达,并以PDGF刺激HSC-T6细胞,建立体外HF模型,研究ASIC1a和ERS在HF发生发展中的作用及其在HSC活化中的相互作用。主要研究内容概括如下:1.ASIC1a及ERS相关蛋白在人肝癌HF肝组织中的表达采用胆管结石患者肝组织作为正常对照组,肝癌并有中、重度HF者肝组织作为HF组,H&E染色观察各组病人肝脏组织标本的病理变化。结果显示:HF病人肝组织出现明显的肝损伤,纤维程度与正常对照组相比有明显的差异。HF标志性因子α-SMA的表达较对照组表达升高。免疫组化检测ASIC1a在人肝癌HF肝组织中的表达,结果显示在人正常肝组织中有ASIC1a的少量表达,HF组表达明显增加。ERS标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78（Glucose-regulated protein 78,GRP78）,较对照组相比,HF组表达明显升高,具显著性差异。提示在人肝癌旁纤维化病理组织中ASIC1a和ERS相关蛋白表达均显著增加。2.ASIC1a和ERS相关蛋白在HF大鼠和PDGF-BB诱导的HSC-T6中的表达使用四氯化碳建立HF大鼠模型,H&E染色观察各组大鼠肝脏病理变化。结果发现,HF大鼠较对照组大鼠有明显的肝脏损伤。Western Blot检测HF大鼠肝组织和PDGF-BB诱导的HSC-T6细胞中ASIC1a和ERS相关蛋白的表达变化。结果显示,在模型大鼠肝组织和HSC-T6细胞中ASIC1a和GRP78,c-Caspase12的表达均较对照组显著增加（P<0.01）,进一步提示ASIC1a和ERS可能参与HF的发生发展。3.ASIC1a对PDGF-BB诱导的HSC-T6活化和增殖的影响给予PDGF-BB（10ng/ml）刺激HSC-T6细胞24h,建立体外HF细胞模型,采用ASIC1a非特异性阻断剂阿米洛利（Amiloride）或ASIC1a特异性阻断剂狼蛛毒（PcTx1）阻断ASIC1a的表达及活性增加;或用特异性的ASIC1a-ShRNA干扰ASIC1a的表达。Western Blot以及q-PCR检测ASIC1a、α-SMA和Collagen I的表达。结果发现,阻断或沉默ASIC1a后,ASIC1a的表达降低,由PDGF诱导HSC中α-SMA和Collagen I的表达明显减少。提示ASIC1a的高表达可能参与PDGF诱导的HSC-T6活化增殖。4.ASIC1a对PDGF-BB诱导的HSC-T6中ERS的影响使用ASIC1a特异性抑制剂PcTx1和ASIC1a-ShRNA下调HSC-T6中ASIC1a的表达。Western Blot检测各组ERS标记蛋白GRP78、c-Caspase12和下游通路IRE1-XBP1的变化。结果发现,与模型组相比,在PcTx1/ASIC1a-ShRNA处理后,ASIC1a的表达明显降低,ERS标记蛋白GRP78、c-Caspase12和下游通路IRE1-XBP1的表达活性均明显降低。q-PCR结果与Western blot结果一致。提示ASIC1a参与PDGF-BB诱导的HSC-T6活化可能与激活ERS有关。5.PI3K/AKT通路对ASIC1a活性表达的作用为进一步探究ASIC1a调控PDGF诱导的HSC-T6活化的具体机制,采用LY294002阻断HSC-T6中PI3K/AKT通路,检测ASIC1a表达及活性变化。MTT和Western Blot筛选LY294002的最佳抑制浓度为15μmol/L。同时发现,在LY294002预处理组,p-AKT的表达减少,PDGF刺激的HSC-T6内ASIC1a高表达也被明显阻断。提示PI3K/AKT通路可能参与PDGF诱导的HSC-T6中ASIC1a的活化。6.PI3K/AKT通路对HSC-T6中ASIC1a膜转运的调节采用细胞免疫荧光法进一步检测PI3K/AKT通路对HSC-T6中ASIC1a膜转运的调节作用。结果显示,在PDGF刺激下HSC-T6中ASIC1a被明显激活,可见绿色荧光从核膜向细胞膜转运,荧光强度明显增加,此膜转运过程能被ASIC1a特异性抑制剂PcTx1及PI3K/AKT通路特异性抑制剂LY294002所阻断。提示PI3K/AKT可能参与PDGF诱导的HSC中ASIC1a的膜转运活化过程。7.PI3K/AKT通路对ASIC1a引起的细胞外钙离子内流的影响采用激光共聚焦技术动态检测HSC-T6细胞内Ca²⁺浓度的变化。使用电压门控钙离子通道阻断剂尼莫地平（10μM）阻断Ca²⁺通道。从共聚焦图片和浓度轨迹结果可知,与对照组相比,PDGF刺激下HSC内Ca²⁺荧光强度明显增强,浓度明显增加。而使用PcTx1对ASIC1a特异性阻断后,可以显著降低由PDGF引起的细胞外钙离子内流。进一步采用PI3K/AKT抑制剂（LY294002）,其结果与PcTx1组相似,提示PDGF可能通过PI3K/AKT通路进而激活ASIC1a通路,诱导细胞外钙离子内流。8.ERS对PDGF-BB诱导的HSC-T6活化和增殖的影响为探讨ERS参与调节HSC-T活化6的具体机制,使用4-PBA作为ERS的抑制剂,MTT和Western Blot筛选4-PBA最佳抑制浓度为1μmol/L。Western Blot结果显示:采用4-PBA抑制ERS后,ERS标志性蛋白GRP78、Caspase12和ERS下游通路IREI-XBP1表达均降低;PDGF诱导的HSC-T6中α-SMA和Collagen I的高表达亦明显降低。提示ERS可能通过IREI-XBP1通路参与调节PDGF诱导的HSC-T6的活化和增殖。9.ERS对PDGF-BB诱导的ASIC1a表达的影响为进一步探讨ERS与ASIC1a在HSC-T6活化中的相互关系,使用4-PBA阻断ERS后,Western Blot检测ASIC1a的表达。结果发现,4-PBA可显著抑制由PDGF诱导的HSC-T6中ASIC1a的高表达;4-PBA给药组尚可明显阻断活化HSC中p-AKT的高表达。结果提示,ERS可以通过对PI3K/AKT通路的调节,进而上调ASIC1a的表达及活性。