乳制品是人们生活中的重要消费品,鲜牛乳质量在很大程度上影响着乳制品的质量,病原菌污染是生乳质量安全问题的重要方面。近年来,奶牛真菌性乳腺炎发生率明显增高,有关鲜牛乳被念珠菌污染的报道越来越多。鲜牛乳中的致病性念珠菌不仅破坏乳品的营养品质,还存在导致人畜感染念珠菌病的风险。所以,在对原料乳中念珠菌分离鉴定的基础上建立特异、灵敏和快速的检测方法,对奶牛念珠菌性乳腺炎的诊治和乳品安全都具有重要意义。本研究从冀南地区的奶牛场随机采集了96份奶样,首先用平板培养和形态观察方法分离出15个疑似念珠菌菌株,后采用rDNA-ITS基因序列分析与形态学结合的方法鉴定出12株念珠菌:其中白色念珠菌8株、近平滑念珠菌2株、光滑念珠菌2株,其余3株为非念珠菌酵母状真菌。念珠菌分离株与GenBank中三种念珠菌的同源性在97.6%~99.8%之间。本研究以天冬氨酸蛋白酶、细胞外磷脂酶和细胞外脂肪酶为指标进行分泌型水解酶检测试验,从而了解其主要毒力因子及强弱。结果显示白色念珠菌和近平滑念珠菌均能产生天冬氨酸蛋白酶、细胞外磷脂酶和细胞外脂肪酶,光滑念珠菌主要产生细胞外磷脂酶;通过对三种念珠菌分泌型水解酶的活性比较来看,可以初步判定白色念珠菌的毒性最强。再选取分泌型水解酶活性最强的白色念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌进行小鼠生存实验,结果显示:注射白色念珠菌的小鼠存活率为10%;注射近平滑念珠菌的小鼠存活率为80%;注射光滑念珠菌的小鼠存活率为60%。进一步验证了白色念珠菌的毒性最强。通过牛奶中厚垣孢子形成和灭菌试验得知,光滑念珠菌在室温下的牛奶中不产生厚垣孢子,白色念珠菌和近平滑念珠菌在室温下的牛奶中容易产生厚垣孢子虽然高压灭菌可将其杀死但巴氏灭菌后厚垣孢子仍会存活。巴氏灭菌结果显示在该试验条件下白色念珠菌厚垣孢子的生成率为9.69%~24.23%,近平滑念珠菌厚垣孢子生成率为16.17%~16.38%。针对GenBank已发表的benAfum基因序列设计了白色念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌的三对特异引物,并建立了检测鲜牛乳中三种念珠菌的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示:该方法能同时扩增出三种念珠菌的特异性目的片段,无引物二聚体,且菌种间的Tm值差异大于等于1℃即可区分;检测白色念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌的灵敏度分别达到了1.63?10~1CFU/mL、1.61?10~1CFU/mL、1.65?10~1CFU/mL,高于常规PCR技术100倍以上;重复性试验荧光曲线和熔解曲线趋于一致;检测速度快,2h即可完成。