研究背景:　　 甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)滥用可以引起神经、心血管、消化、内分泌、泌尿及生殖系统的毒性损伤。既往研究多集中在METH的中枢神经毒性、成瘾依赖机制的探讨,随着METH的使用日趋广泛,近年来滥用者使用后发生急性冠脉综合症、猝死等心脏突发事件的报道越来越多,METH心血管毒性作用的研究也逐渐得到重视。　　 目前研究认为:①METH是心血管病变的高危因素,急性使用METH可导致胸痛、心律失常、心悸、血压升高,慢性滥用可导致心肌病、慢性高血压；②不论使用期长短,METH滥用都是慢性心血管病变的危险因素,但慢性METH滥用者心血管病变更为严重；③长期滥用METH可导致极为严重的急、慢性心脏损伤,如急性冠脉综合症、急性心肌梗死、主动脉夹层动脉瘤和心源性猝死；④使用METH可以加重已有的心脏病理学变化,增加心血管事件的发生率；⑤METH引起的心血管事件不是单纯由使用量和使用时间长短决定,其他因素也起着很重要的作用；⑥METH最可能的致死原因为致命性心律失常、心肌缺血和心肌损伤。　　 离子通道是产生心肌细胞动作电位的基础,心肌细胞几个重要离子通道--钠、钾、钙离子通道的电生理活动紊乱可直接导致心律失常的发生。关于METH对心肌细胞电生理活动的影响国内外报道非常少见,最新研究有学者应用Langendorff离体灌流装置对小鼠心脏进行METH给药,30分钟后检测相关指标,结果显示METH可以导致心肌细胞内Ca2+处理异常并直接抑制心肌细胞收缩功能。有学者对成年大鼠单个心肌细胞进行急性给药后再洗脱,首次发现METH可以抑制成年大鼠心室肌细胞的瞬时外向钾电流(Ito)、内向整流钾电流(Ik1)、L型钙电流(ICa-L)。但不同剂量METH导致心肌损伤的程度、是否直接和通道亚基基因、蛋白表达有关,尚需更多的实验证明。　　 L-型钙离子通道(LTCCs)是细胞外Ca2+进入细胞的重要门户,是心肌兴奋-收缩偶联的重要结构,ICa-L在心肌细胞动作电位形成中具有重要作用。构成心肌细胞LTCCs的重要亚单位有α1c、β2、α2/δ,各亚单位的表达改变与ICa-L的改变相关。临床报道,对使用METH后发生心血管异常症状的患者使用地高辛、钙离子通道阻滞剂,有缓解症状、改善心血管功能的作用。说明METH可能导致LTCCs功能和表达的改变,这些改变在METH引起心血管损伤,特别是心律失常的过程中起着一定的作用。　　 本实验从体外、体内两个体系入手,主要研究METH中毒大鼠心室肌LTCCs功能和表达的变化,以探讨METH的心肌毒性作用,特别是室性心律失常发生的机制。　　 目的:　　 从体内、体外两个体系入手,构建METH中毒大鼠模型及METH染毒大鼠心室肌细胞模型,以了解METH对心室肌细胞的直接和间接损伤作用,探讨METH导致LTCCs功能及表达的影响和METH导致室性心律失常发生的电生理机制和分子机制。　　 方法:　　 一、静脉给予大剂量METH(40mg/Kg)后大鼠血压、心电监测　　 ①180-220g雄性SD大鼠46只,随机分为实验组和对照组各23只。实验组麻醉后给予股动脉插管,远端通过三通装置与注射器和压力传感器相连,经三通装置输入压力换能器,再输入PowerLab计算机数据采集系统记录动脉血压。股静脉插管,留置给药。输入后观察十分钟,待平均动脉压平稳、心律稳定后通过股静脉插管缓慢注射给药,给药量为40mg/Kg体重的METH生理盐水溶液(对照组以等量生理盐水代替)。双上肢及右下肢接电极,监测心电变化。　　 ②死亡大鼠死后立即取脑、心、肺、肝、脾、肾等重要器官,放入4％中性甲醛中固定,备做HE及特殊染色。超过六小时依然存活的大鼠,下机结扎股动、静脉,缝合皮肤,喂以食、水,观察到48h,10％水合氯醛麻醉后处死,同样取材及处理。　　 二、急、慢性METH中毒大鼠心肌损伤研究　　 1.急、慢性METH中毒动物模型的建立:　　 ①180-220g雄性SD大鼠48只,随机分为急性实验组(AT)和急性对照组(AC),每组各24只。实验组动物腹腔注射METH(对照组以等量生理盐水代替),剂量为15mg/Kg体重,每天早8:00点晚6:00点各注射一次,连续给药4天,共8次,制成METH急性中毒动物模型。　　 ②180-220g雄性SD大鼠48只,随机分为慢性实验组(CT)和慢性对照组(CC),每组各24只。实验组动物腹腔注射METH(对照组以等量生理盐水代替),剂量为5mg/Kg体重,每天晚6:00注射,连续给药8周,共56次,制成METH慢性中毒动物模型。　　 给药10分钟后,观察动物行为变化。急性中毒模型每天称量大鼠体重,慢性中毒模型每周两次称重。各组大鼠末次给药后24h麻醉后处死,取心并称重,统计心脏系数变化。取材后观察心、脑、肺、肝、脾、肾等主要脏器的组织学变化。　　 2.急性建模组每次给药后1h监测大鼠心律、平均动脉压；慢性建模组每周监测(给药后1h)两次大鼠心律、平均动脉压。　　 3.形态学观察:心脏取材后制作石蜡切片,进行HE/PTAH/HBFP染色,光镜下观察心肌形态学改变；抗心肌LTCCsα1c、β2亚基免疫组化染色,计算机图像分析系统半定量分析染色光密度,比较各组大鼠心肌病变情况和免疫组化染色差异。　　 4.逆转录实时荧光定量-PCR技术:两步法扩增检测各组心室肌组织LTCCsα1c、β2亚基mRNA表达量的变化。　　 5.Western Blot:免疫印迹技术检测各组心室肌组织LTCCsα1c、β2亚基蛋白表达量的变化。　　 三、METH染毒乳鼠心室肌细胞毒性损伤　　 1.建立METH心室肌细胞染毒模型:取1日龄新生SD大鼠进行心室肌细胞原代培养,用METH染毒(0.5/1.5/2.5mM梯度给药并设置对照)培养48h己呈规律波动的心室肌细胞,观察各组细胞形态、波动百分比和超微结构的改变。　　 2.电生理实验:METH梯度给药24h,细胞尚未出现明显肉眼病变时,取各组心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术分别记录四组细胞的ICa-L,观察病毒感染后细胞膜电容、电流密度、电压依赖激活和失活等动力学参数的变化。　　 3.逆转录实时荧光定量-PCR技术:同批培养的心室肌细胞METH梯度给药后,检测LTCCsα1c、β2亚基mRNA表达量的变化。　　 4.Western Blot:同批培养的心室肌细胞METH梯度给药后,检测LTCCsα1c、β2亚基蛋白表达量的变化。　　 结果:　　 一、静脉给予大剂量METH大鼠　　 1.实验组:23只大鼠,6min内死亡的9只,2-6h死亡的11只,存活的3只。对照组:23只全部存活。　　 2.血压变化:　　 6min以内发生死亡的大鼠:给药后平均动脉压轻度波动后立即持续性下降,数分钟内下降至20mmHg以下,随即死亡。　　 2-6h死亡的大鼠:给药后平均动脉压轻度波动后上升并维持在一个相对较高的水平,一段时间后下降至正常水平,继续缓慢下降至20 mmHg以下,随即死亡。　　 存活大鼠:给药后平均动脉压轻度波动后上升并维持在一个相对较高的水平,一段时间后下降至正常水平,继续缓慢下降至80—100mmHg,之后血压维持在此水平,结扎拔管后存活大于48h。　　 对照组大鼠血压全程无明显变化,平均动脉压维持在90—120mmHg,拔管结扎后存活大于48h。　　 3.心电变化:　　 给药后死亡大鼠:心率增快,监测过程中可见频发室上速、室内分支传导阻滞、房室传导阻滞及ST段异常、QRS波形异常。　　 给药后存活大鼠:心率增快,偶发室上速及传导阻滞,未见ST段异常。　　 对照组大鼠:心率平稳,窦性心律,心电图未见异常。　　 4.心脏病理学改变:　　 给药后死亡大鼠:心肌细胞不同程度的波浪样改变、收缩带坏死、肌溶灶形成、间质水肿、出血。　　 给药后存活大鼠:心肌细胞波浪样改变、盘结样改变,间质水肿。　　 二、急、慢性METH中毒动物心肌损伤　　 1.AT组大鼠体重、行为学评分与对照组相比有显著性差异(P<0.05、P<0.01)；心率和平均动脉压显著高于对照组(P<0.01、P<0.01)。CT组大鼠体重、行为学评分与对照组相比有显著性差异(P<0.01、P<0.01)；心率和平均动脉压显著高于对照组(P<0.01、P<0.01)；CT组大鼠心脏系数增高,与对照组差异有统计学意义(t=7.721,P<0.01)。　　 2.光镜下,AT组大鼠心肌细胞程度不一的波浪样改变、收缩带坏死、肌溶灶形成、间质纤维增多、出血及少量炎性细胞浸润,可见心肌细胞收缩带坏死。CT组大鼠心肌细胞和胞浆空泡、肌溶灶形成、间质出血、偶见收缩带坏死。AT、CT组大鼠心肌均可见程度不同的缺血性改变,缺血心肌呈片状、条带状。AT、CT组大鼠均有LTCCsα1c、β2亚基阳性染色,与各自的对照组有显著差异性(P<0.01、P<0.01)。　　 3.AT、CT组大鼠心肌LTCCsα1c、β2亚基mRNA表达水平较各自的对照组升高(P<0.01、P<0.01),实验组间、对照组间无显著差异性。　　 4.AT、CT组大鼠心肌LTCCsα1c、β2亚基蛋白表达水平均较各自的对照组升高(P<0.01、P<0.01),实验组间、对照组间无显著差异性。　　 三、METH染毒乳鼠心室肌细胞　　 1.正常培养的新生SD大鼠心室肌细胞呈规律性搏动,METH梯度给药0-24h,给药组细胞搏动增快；24-48h后,0.5mM给药细胞搏动尚好,肉眼未见明显改变；1.5mM组细胞搏动逐渐减慢,并逐渐出现变圆、扁缩等细胞形态学改变,最终细胞停止搏动,自皿上脱落、死亡:2.5mM给药细胞出现同1.5mM组细胞的类似改变,且改变更加明显(搏动更慢、脱落、死亡细胞更多)；对照组细胞呈规律性搏动。电镜下观察,随着给药浓度增高,出现细胞内溶酶体增多、线粒体空泡变性、细胞膜破裂等超微结构的改变,以2.5mM组细胞最为明显。　　 2.全细胞膜片钳记录显示,对照组及0.5/1.5/2.5mM组心室肌细胞膜电容无显著差异(53.39±7.67pF vs52.38±8.38pF,51.74±6.88 pF,51.30±7.68 pF,各组间P>0.05,n=9)。三给药组心室肌细胞ICa-L的平均密度在-20～+10mV测试电压范围内均显著低于对照组细胞(P<0.05,n=9)；在0mV,与对照组相比,0.5/1.5/2.5mM峰电流密度降低分别为27.4％、24.9％、56.6％；2.5mM组降低程度与其他两给药组相比有显著差异性,0.5mM、1.5mM组间无统计学差异。电压依赖性通道激活及失活动力学过程在四组细胞之间无显著性改变(P<0.05,n=9)。　　 3.0.5/1.5/2.5mM组心室肌细胞LTCCsα1c亚基mRNA表达量较对照组减少,差异有统计学意义(P<0.01),β2亚基mRNA表达量较对照组增多,差异有统计学意义(P<0.01),2.5mM给药组改变较0.5mM、1.5mM给药组显著(P<0.01),0.5mM和1.5mM组间比较无显著差异性。　　 4.0.5/1.5/2.5mM组心室肌细胞LTCCsα1c亚基蛋白表达量较对照组减少,差异有统计学意义(P<0.01),β2亚基蛋白表达量较对照组增多,差异有统计学意义(P<0.01),2.5mM给药组改变较0.5mM、1.5mM给药组有显著差异性(P<0.01),0.5mM和1.5mM组间比较无显著差异性。　　 结论:　　 1.METH可导致大鼠心率增快,血压升高、降低或双向变化,室上速、室内分支传导阻滞、房室传导阻滞及ST段异常、QRS波形异常等多种心律失常。　　 2.METH染毒可对体外培养的心室肌细胞产生直接损伤作用,以1.5mM浓度给药最适合METH心室肌细胞毒性研究,可作为体外研究METH心室肌毒性损伤的细胞模型。METH滥用可以导致动物心肌组织损伤,急性损伤表现为心律失常和急性心肌缺血,慢性损伤表现为慢性心肌缺血和心肌肥大。　　 3.体外实验发现:METH染毒心室肌膜ICa-L的平均密度降低,LTCCs功能性亚基α1c和调节性亚基β2在转录及翻译水平的表达分别为下降、上调。体内实验发现:急、慢性METH中毒大鼠心室肌组织LTCCsα1c亚基和β2亚基在转录及翻译水平的表达均上调。　　 METH可以直接作用于心室肌细胞,抑制LTCCs的功能和表达,导致心律失常和心室肌细胞损伤。