目的:为了揭示神经退行性病变中神经元损伤的潜在胞内病变机制,我们研究小胶质细胞在喹啉酸介导的神经兴奋性毒性模型中发挥的作用,并对其作用机制进行研究探讨。
　　方法:本实验首先将1mM喹啉酸作用于BV-2细胞12h后,采集培养基上清液,制备BCM(BV-2 Conditioned Medium)。然后向体外培养的原代皮层神经元,分别加入喹啉酸和BCM,建立兴奋性毒性模型。通过Hochest染色和β-tubulin染色检测神经元胞核及细胞骨架损伤程度,Western blot,免疫细胞荧光染色检测BV-2小胶质细胞内NF-κB的活化,荧光半定量反转录-聚合酶链反应、ELISA检测NF-κB活化引起的细胞因子合成及分泌改变。
　　结果:本研究建立的兴奋性毒性模型中,1mM喹啉酸不足以直接引起神经元损伤,但可以通过激活小胶质细胞,间接对神经元产生强烈的毒性作用。Western blot结果显示,1 mM喹啉酸可以激活小胶质细胞,致其IκB磷酸化并降解,NF-κB核转位;免疫细胞荧光染色结果显示,喹啉酸作用过的BV-2小胶质细胞核内NF-κB升高,且该作用可被小胶质细胞活化抑制剂抑制;荧光半定量PCR检测NF-κB核转位引起的细胞因子mRNA水平变化,发现在动物兴奋性毒性实验模型中发生明显改变的三种细胞因子:iNOS mRNA在加入喹啉酸1 h后有略有下降,随后逐渐升高;IL-1βmRNA在加入喹啉酸1 h后有一过性升高,随后逐渐降低至基线水平;而TNF-αmRNA则呈现出持续增加的趋势。采用小胶质细胞激活抑制剂抑制小胶质细胞激活,或采用TNF-α拮抗剂降低TNF-α水平,均可以减轻神经元损伤程度。证明小胶质细胞主要通过释放TNF-α参与喹啉酸介导的神经元兴奋性毒性损伤。再者,向空白培养基内加入外源性TNF-α,能成功模拟BCM对体外培养的皮层神经元造成的损伤。
　　结论:本实验室先前的工作证明喹啉酸可引起TNF-α和FasL增加,抑制NF-κB可以阻断喹啉酸引起的TNF-α和FasL增加。本课题证明活化的小胶质细胞通过TNF-α参与了喹啉酸引起的神经兴奋性毒性过程,提示抑制小胶质细胞活化或减少促炎细胞因子的产生可能对神经兴奋性毒性的发生有一定预防作用,由此对神经退行性疾病的治疗思路提供参考。