目的:人晶状体上皮细胞对维持人晶状体组织正常生理功能起着极其重要的作用,当其受到氧化损伤时,晶状体内部稳态受到破坏,可能加快白内障进展。当前对人晶状体上皮细胞氧化损伤有较多的研究,但是仍然不能明确氧化损伤的来源、发病环节以及详细的分子机制。最新的研究表明,生理条件下,人晶状体上皮细胞处于低氧环境中,氧分压约为3~7mmHg(1kPa=7.5mmHg),相当于体积分数1%的氧含量,生理氧状态(physiological hypoxia)下的人晶状体上皮细胞对氧浓度的变化较为敏感。而多数既往人晶状体上皮细胞的研究都是在体积分数21%的常规氧环境中完成,与生理状态有较大差异。本研究旨在探讨生理氧条件下培养的人晶状体上皮细胞与常规氧环境下培养的人晶状体上皮细胞在抗氧化能力上的差异,初步探讨参与氧化损伤的关键基因的差异,为后续更深入的分子机制和功能研究奠定基础。方法:1.人晶状体上皮细胞系HLEB3复苏并连续传代培养至状态稳定后,分别置于体积分数21%的常氧培养箱、体积分数1%的低氧培养箱孵育24h,消化、超速离心后收集细胞上清分别检测SOD、CAT酶活性以及GSH含量。两种培养环境下的细胞分别接种至96孔板,与含H2O2浓度为0μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,75μmol/L和100μmol/l的培养液共孵育24h,mtt检测细胞活力。2.人晶状体上皮细胞分为常氧实验组、常氧对照组、生理氧实验组和生理氧对照组,实验组与含h2o2浓度为75μmol/l的培养液共孵育24h,对照组与不含h2o2的培养液共孵育24h。提取各组细胞总rna,质检合格后进行microrna芯片检测和表达谱芯片检测。筛选出符合差异标准的microrna和mrna,并利用生物信息学技术对差异表达的mrna进行聚类分析。对芯片检测出的差异基因,用qrt-pcr鉴定其差异是否与芯片结果相符。结果:1.生理氧组细胞的sod酶活性、cat酶活性以及gsh含量分别为:124.36±6.48u/mgprotein,13.28±0.74u/mgprotein和136.63±5.21μg/ml。常氧组细胞的sod酶活性、cat酶活性以及gsh含量分别为:168.78±7.51u/mgprotein,15.02±0.86u/mgprotein和163.96±4.76μg/ml。常氧组细胞的sod酶活性高于生理氧组35.72%(p<0.01,n=3),cat酶活性高于生理氧组13.10%(p<0.05,n=3),gsh含量高于生理氧组20.02%(p<0.001,n=3)。常氧组细胞在加入含h2o2浓度为0μmol/l,25μmol/l,50μmol/l,75μmol/l和100μmol/l的现配培养液培养24h后,细胞活力分别为100±4.98%,95.60±3.57%,86.40±7.02%,74.09±8.50%和44.59±5.25%。生理氧组细胞的活力分别为100±6.66%,86.40±4.12%,68.64±4.66%,53.63±6.03%和9.26±2.04%。常氧组细胞的活力在h2o2处理浓度为25μmol/l时高于生理氧组10.64%(p<0.01,n=5),h2o2处理浓度为50μmol/l时高于生理氧组25.88%(p<0.001,n=5),h2o2处理浓度为75μmol/l时高于生理氧组38.15%(p<0.01,n=5),h2o2处理浓度为100μmol/l时高于生理氧组381.44%(p<0.001,n=5)。2.microrna芯片检测结果显示:常氧对照组与常氧实验组比较发现,常氧条件下氧化损伤诱导mir-34b-5p,mir-630,mir-222-5p表达上调,mir-15b-3p表达下调;生理氧对照组与生理氧实验组比较发现,生理氧条件下氧化损伤诱导mir-630表达上调,mir-335-3p表达下调;生理氧对照组与常氧对照组比较发现,生理氧环境诱导mir-210表达上调;生理氧实验组与常氧实验组比较发现,生理氧环境下氧化损伤诱导mir-145-5p,mir-193b-3p,mir-630,mir-210表达上调。qrt-pcr验证mir-630,mir-210的表达量差异与芯片结果相符。3.mrna表达谱芯片及聚类分析结果显示:1)常氧对照组与常氧实验组比较,常氧条件下氧化损伤诱导367个mrna表达上调,154个mrna表达下调。聚类分析结果显示,上调的基因富集于310个相关分类中,富集值最高的分类为p53信号通路、细胞凋亡通路、细胞程序性死亡通路等,下调的基因富集于110个相关分类中,富集值最高的分类为细胞外基质相关通路等。2)生理氧对照组与生理氧实验组比较,生理氧条件下氧化损伤诱导867个mrna表达上调,466个mrna表达下调。聚类分析结果显示,上调的基因富集于430个相关分类中,富集值最高的通路为p53信号通路、细胞凋亡通路、细胞程序性死亡通路等,下调的基因富集于185个相关分类中,富集值最高的分类为细胞外基质相关通路等。3)生理氧对照组与常氧对照组比较,生理氧条件下氧化损伤诱导319个mrna表达上调,83个mrna表达下调。聚类分析结果显示,上调的基因富集于202个相关分类中,富集值最高的分类为低氧反应、细胞外基质、糖代谢等,下调的基因富集于35个相关分类中,富集值最高的分类为细胞免疫反应等。4)生理氧实验组与常氧实验组比较,生理氧条件下氧化损伤诱导501个mrna表达上调,119个mrna表达下调。聚类分析结果显示,上调的基因富集于352个相关分类中,富集值最高的分类为低氧反应、细胞凋亡、氧化还原酶活力等,下调的基因富集于125个相关分类中,富集值最高的分类为细胞趋化、细胞迁移等。5)qrt-pcr验证ddit4、edn1、egln1、vldlr、vegfa的表达量差异与表达谱芯片结果相符。结论:生理氧条件下培养的人晶状体上皮细胞的抗氧化损伤能力弱于体积分数21%的常规氧环境中培养的细胞。两种培养环境下的细胞在受到氧化损伤时,在表达谱水平存在广泛的差异,提示相应的抗氧化损伤机制可能存在差异。在microrna水平上,两种培养环境下的细胞在受到氧化损伤时其mir-630均有明显的表达上调,提示miR-630是参与氧化损伤分子机制的重要microRNA;生理氧环境下细胞miR-210的表达水平明显高于常氧组细胞,而且生理氧实验组细胞的miR-630表达量也显著高于常氧实验组,提示miR-210可能是导致两种培养环境下的细胞抗氧化损伤机制差异的关键microRNA。两个microRNA之间的相互作用,它们下游调控的的靶基因等还需要结合表达谱芯片结果以及更深入的分子机制及功能研究来阐明。