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蛋白质作为生命的物质基础,是生命活动的主要承担者,参与了生命几乎所有过程。对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制,是后基因组时代生命科学研究极富挑战的领域之一。然而,很多具有重要生理功能和临床价值的蛋白质含量低、结构复杂且动态变化。同时,生物样品组成复杂,存在大量的干扰物质。因此,特异性地识别和分离目标蛋白质成为蛋白质研究的瓶颈。经典的蛋白质研究方法是以抗原-抗体识别为基础,已经在蛋白质的分离、纯化、识别和检测方面发挥了重要作用。但是使用的抗体主要来源于动物免疫,其制备工艺复杂、成本高昂、筛选周期长,有时甚至无法得到。此外,抗体的稳定性和重复性也存在问题。因此,寻找抗体的替代物不仅具有重要科学意义,而且具有重要的应用价值。分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)是一种模拟抗体识别抗原的化学合成材料。由于存在与模板分子形状、尺寸和功能基团高度互补的纳米印迹腔,MIPs对模板分子具有类似抗体的结合特性。MIPs制备简单、价格低廉、比抗体更稳定,并且可以耐受各种pH、溶剂和温度。近年来,已经涌现出许多分子印迹技术用于蛋白质的印迹。特别是,本课题组发展的硼亲和印迹法有效解决了糖蛋白和糖肽等含顺式二羟基化合物的印迹,具有简单、通用、高效等优点,已经在疾病诊断、生物成像、单细胞分析等领域展现出良好的应用前景。然而,该方法只适用于糖蛋白和糖肽的印迹,而无法印迹非糖蛋白和非糖肽。本文在课题组前期建立的硼亲和可控定向表面印迹法的基础上,引入表位印迹技术,成功发展出两个适用于各种蛋白质类型(含非糖蛋白、非糖肽、糖蛋白和糖肽)的可控印迹方法,通过多个蛋白质验证,证明了提出的方法高效、便捷和通用。制备的MIPs已经成功应用于蛋白质的特异性识别、蛋白质生物标志物的疾病诊断,以及肿瘤细胞的靶向识别和成像分析。首先,我们提出了硼亲和锚定表位可控定向表面印迹法,用于蛋白质的印迹。选择蛋白质的C端九肽作为表位,在其C端先引入一个赖氨酸,再与果糖反应进行糖化,得到的糖化表位模板很容易在硼酸功能化的基底材料上进行固定。选择多种与表位序列具有相互作用的硅烷化试剂作为单体进行聚合,不仅提供了多重相互作用,提高了亲和力,而且能够通过调整印迹时间精确控制印迹层厚度。制备的MIPs具有特异性高、亲合力强、传质速度快、印迹效率高等优点,在复杂样品中能够特异性结合目标蛋白质及其表位。因此,提出的蛋白质印迹方法简单、通用、高效,在蛋白质的识别及生物医学应用中具有广阔的应用前景。其次,我们发展了基于双重MIP的等离激元免疫夹心法(dual MIP-based plasmonicimmunosandwichassay,duMIP-PISA),用于高特异性、超灵敏度检测复杂生物样品中蛋白质生物标志物。首先将硼亲和锚定表位可控定向表面印迹法扩展到了 N端表位的印迹。然后,将蛋白质生物标志物的C端和N端的表位糖化后作为模板,分别制备了 C端表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃板,作为等离激元基底用于特异性萃取目标蛋白质,以及N端表位印迹的拉曼响应的Ag@SiO2纳米粒子,作为纳米标签用于特异性标记捕获的蛋白质。形成的MIP-蛋白质-MIP三明治复合物可以产生显著增强的表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)信号。基于 MIP 的双重识别保证了检测的高度特异性,同时SERS检测提供了超高的灵敏度。duMIP-PISA已经成功测定了人血清中神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE),利用NSE的表达水平差异可以区分出健康人与小细胞肺癌病人。与传统的免疫分析相比,duMIP-PISA具有操作简单、检测速度快、所需样品体积少和线性范围宽等优点,而且很容易修改并扩展应用到其他蛋白质生物标志物。因此,duMIP-PISA在疾病诊断、生化研究和信号通路等领域将发挥重要作用。最后,我们提出了硼亲和锚定表位可控定向表面双层印迹法,用于制备特异性更高、亲和力更强的蛋白质印迹聚合物。选择蛋白质的C端或N端十二肽作为表位进行糖化,通过硼亲和作用将糖化表位固定在硼酸功能化的基底材料上。首先对前九个氨基酸序列通过多种硅烷化试剂聚合进行第一次定向印迹,所得印迹空腔对表位多肽具有多重相互作用,从而产生高的亲和力;然后,对后三个氨基酸序列通过原硅酸四乙酯聚合进行第二次定向印迹,形成的印迹层覆盖了第一次定向印迹在印迹腔外产生的非特异性吸附位点,从而降低了在非印迹表面的非特异性吸附。传统的单次印迹方法获得最高的印迹因子只有6.2,最低的解离常数为10-7M;而通过两次印迹方法,获得最高的印迹因子达到16.6,最低的解离常数降低至10-9M,亲和力比传统的单次印迹方法的提高了两个数量级。根据氨基酸的性质,对蛋白质的C端或N端表位进行优化的印迹条件已经证明同样适用于其他蛋白质的印迹,制备的MIPs在肽段和蛋白水平均表现出优异的特异性。同时,制备的分子印迹荧光纳米粒子实现了肿瘤细胞表面转铁蛋白受体的靶向识别和成像分析。因此,该方法为蛋白质的仿生识别提供了识别性能更为先进的分子印迹材料,有望在生物医学中得到广阔的应用。