CCL28是属于小分子量细胞因子CC基因亚家族的粘膜相关上皮趋化因子,在正常人体的不同粘膜部位如腮腺、乳腺、气管及结肠等均有不同程度的表达。除了具备广谱抗菌效果、参与免疫屏障的作用外,CCL28在各类上皮肿瘤细胞系也呈现高表达。研究发现人源CCL28与小鼠、大鼠、猪和羊等动物源CCL28在氨基酸水平上的同源性高达60%以上。然而CCL28与其受体CCR3/CCR10的互作机制、CCL28能否作为疫苗粘膜佐剂、CCL28能否作为肿瘤治疗靶点等尚需进一步深入研究。为探究CCL28的相关生物学作用,本研究在克隆表达人源CCL28基因的基础上,研制出了针对人源CCL28的特异性单克隆抗体,且以裸鼠结肠癌肿瘤模型初步测试了单抗的治疗效果。1、人源CCL28基因克隆表达与多抗制备为获得用于制备人源CCL28单克隆抗体的免疫原和筛选抗原,本实验根据Genbank对CCL28基因的分析,设计并合成了特异性的引物,并将其克隆至pcDNA3.1载体上,成功获得了真核表达质粒pCDNA3.1-CCL28。将阳性重组子pGEX-6P-1-CCL28转接至BL21感受态细胞中、经IPTG诱导表达获得了可溶性的融合蛋白GST-CCL28。纯化的GST-CCL28免疫小鼠制备了抗CCL28多克隆抗体。Western Blot证明获得的多抗不仅能与原核表达产物GST-CCL28反应,而且能识别真核表达质粒表达的CCL28。以上融合蛋白GST-CCL28的获得,CCL28真核表达质粒的构建及抗CCL28多克隆抗体的制备为研制抗CCL28单克隆抗体提供了材料。2、人源CCL28单克隆抗体的研制为了获得针对人源的CCL28单克隆抗体,本研究用获得的重组蛋白GST-CCL28免疫6周龄BALB/c小鼠,取加强免疫的小鼠进行细胞融合。以转染pcDNA3.1-CCL28重组质粒的293T细胞为筛选抗原,通过IFA筛选出分泌抗CCL28抗体的细胞株,进行亚克隆后得到一株针对CCL28的单克隆抗体,命名为5A3。其亚类鉴定为IgG2b,轻链为κ链。IFA与Western blot均证明单抗5A3可以很好地与外源性表达的CCL28发生特异性反应,荧光效价在1:12800以上。表位鉴定证实单抗5A3能识别CCL28的80aa-96aa位的重要功能区域。抗CCL28单克隆抗体的研制及其识别表位的鉴定为进一步探究CCL28的生物学功能及其在肿瘤治疗中的作用打下了基础。3、人源CCL28单克隆抗体抗肿瘤作用初探由于CCL28在各类上皮肿瘤细胞系呈现高表达,且CCL28的拮抗剂能协同参与治疗乳腺癌患者,为探究抗人源CCL28的鼠源单克隆抗体能否作为有效拮抗剂用于人类肿瘤中的治疗,本研究在用人结肠癌细胞系HCT116-P53+/+建立裸鼠结肠癌肿瘤模型的基础上,利用研制的抗CCL28单克隆抗体5A3尾静脉注射和肌肉注射进行了初步肿瘤治疗探索,定期观察裸鼠肿瘤生长情况。经周期性记录肿瘤数据发现,抗人源CCL28单克隆抗体5A3相对于对照单克隆抗体对肿瘤增长速度虽有一定抑制效果,但经统计分析两者没有显著差异。以上初步结果表明抗CCL28单克隆抗体5A3对肿瘤的治疗效果有待于进一步评价。