人口老龄化现已是全世界所面临的难题。本论文以自然衰老小鼠为研究对象,评价黄芪对自然衰老小鼠整体衰老表型的作用,进一步聚焦于肠道衰老,探讨黄芪对自然衰老小鼠肠道功能及菌群稳态的影响,为抗衰老机制研究提供依据,具体研究内容以及结果如下:一、文献综述与分析第一部分首先对衰老的定义以及其现状进行阐述,目前临床上并无经济有效的方式延缓衰老,因此,对延缓衰老药物的研究与开发是国内外学术界及产业界持续关注的热点。中药多靶点多环节的作用机制以及其部分能够药食两用的特性是延缓衰老的一个重要方向,黄芪抗衰老的有效成分以及其抗衰老作用在多种方面已有报道并且具有显著疗效。本部分整理归纳了黄芪的有效成分在抗衰老中的应用,发现黄芪在改善肠道衰老方面研究较少,且缺乏深度。此外,在衰老模型的选择上,也多集中于D-半乳糖诱导的衰老加速模型以及快速老化小鼠模型,较少采用自然衰老小鼠模型进行研究,因此在黄芪延缓肠道衰老的药效与机制方面留有较大空白,需要进行进一步的探索。第二部分对于肠道衰老与肠道菌群的研究现状进行归纳分析。首先对于肠道衰老的具体表现进行阐述,重点介绍了肠道干细胞以及影响其增殖与分化的相关信号通路。其次,在肠道中存在着肠道菌群,肠道菌群的紊乱也是衰老的重要推动因素。本部分也归纳了在衰老进程中肠道菌群的改变,以及肠道菌群的紊乱与衰老相关疾病的联系。最后,总结肠道菌群的主要代谢产物对于肠道衰老的影响。促进肠道干细胞的增殖与分化以及对于肠道菌群紊乱的调节可能是探索黄芪延缓肠道衰老的重要突破口,但其具体机制还需要进一步研究。二、黄芪对于不同月龄以及不同性别衰老小鼠的药效学评价1.黄芪对于不同月龄以及不同性别衰老小鼠的衰老表型作用为了探讨黄芪对于自然衰老小鼠的抗衰老作用,本研究首先将黄芪的醇提部位和多糖部位合并,制得黄芪总提物,采用18月龄雄性小鼠,观察黄芪总提物对于18月龄雄性小鼠整体衰老表型的影响,包括“虚弱指数”,由31种表现型组成,这些表现型是年龄相关健康恶化的指标,以及各系统的衰退情况,主要包括神经系统,心血管系统,泌尿系统,呼吸系统,消化系统等,同时对于衰老小鼠的系统炎症,基础代谢等情况进行检测。研究结果显示,黄芪总提物对于18月龄雄性小鼠的皮毛,耐力,视力,心脏功能,肾脏,肠道功能等多方面都有显著性的改善作用,同时黄芪总提物也能增加衰老小鼠的基础代谢,提高其O2,CO2的消耗以及热量的产生,并且改善其系统炎症。综上,黄芪总提物能够从整体上改善小鼠的衰老表型。文献报道,多糖是黄芪的主要活性部位,因此,在明确黄芪总提物对于18月龄雄鼠的抗衰老作用后,我们进一步观察黄芪多糖对于18月龄雄鼠的影响,黄芪多糖对于18月龄雄鼠衰老表型以及脏器功能无显著性影响,但对于肠道衰老有一定的改善作用,具体表现为黄芪多糖能够促进肠道葡萄糖吸收以及减少肠道转运时间。以上结果提示黄芪总提物与多糖能够改善18月龄雄性小鼠的衰老表型。在明确黄芪对18月龄雄性小鼠的抗衰老作用之后,本研究采用18月龄雌性小鼠,分别观察黄芪总提物和多糖对其整体衰老表型的影响。结果发现,黄芪总提物能够显著改善衰老小鼠的耐力,增加其游泳时间和悬挂力,改善衰老雌鼠脊柱侧弯的情况。黄芪总提物对于小鼠脏器功能也有一定的影响,能够改善小鼠视力情况。在肠道衰老方面,黄芪总提物能够促进衰老小鼠的葡萄糖吸收以及脂肪吸收,增加血中葡萄糖、游离脂肪酸以及甘油三脂的浓度,促进淀粉酶的分泌,此外,黄芪总提物对于衰老小鼠肠道组织形态也有一定的改善作用,衰老会导致小肠代偿性增长,小肠绒毛高度降低,黄芪总提物能够缩短小肠长度,增加小肠的绒毛长度。黄芪多糖能够增加18月龄雌鼠的耐力,增长衰老小鼠的游泳时间,增加其悬挂力。黄芪多糖能够缓解衰老雌鼠脊柱侧弯的情况,改善其视力功能。对于衰老小鼠出现的系统炎症,黄芪多糖能够减轻脾脏重量与脾脏指数,降低血浆中TNF-a的水平。黄芪多糖能够改善肠道的吸收功能,使得衰老小鼠对于甘油三酯和游离脂肪酸的吸收增加,黄芪多糖给药组回肠中脂肪酶的分泌也增多。黄芪多糖能够降低结肠中的TNF-a水平,减轻肠道炎症。黄芪多糖也能改善衰老小鼠肠道病理情况,增长小肠绒毛长度并且增加结肠中黏液层厚度。以上结果表明,黄芪总提物与多糖对18月龄雌鼠衰老表型有改善的作用。在明确黄芪总提物以及黄芪多糖对于18月龄小鼠的抗衰老药效后,我们采用23月龄雌性小鼠,进一步评价黄芪具体活性部位即黄芪多糖与黄芪醇提物对其整体衰老表型的作用。研究结果显示,黄芪多糖能够增强23月龄雌性小鼠的肌肉力量与耐力,增强小鼠的前肢抓力与悬挂力。对于衰老所引起的肿瘤有较好的抑制作用,同时,黄芪多糖能够减轻脾脏重量,降低脾脏指数,改善肠道衰老,增加肠道对于葡萄糖的吸收,降低肠道转运时间。衰老小鼠肠道绒毛长度缩短,黄芪多糖可以增长绒毛长度。同时,衰老小鼠结肠黏液层厚度减少,黄芪多糖也能增加其黏液层厚度。黄芪醇提物能够改善23月龄雌性小鼠的肌肉力量与耐力,对由衰老引起的肿瘤有显著的抑制作用,此外,黄芪醇提物能够增加肠道对于葡萄糖的吸收。以上结果表明,黄芪多糖与黄芪醇提物对于23月龄雌鼠的衰老表型具有一定的改善作用。值得注意的是,无论是黄芪多糖还是黄芪醇提物,对于23月龄雄性小鼠,在衰老表型,各脏器功能,系统炎症,以及肠道衰老等方面均无显著性影响。2.各方面的对比2.1黄芪对于不同性别老年小鼠作用特征的比较将黄芪对18月龄雌鼠与雄鼠的抗衰老药效进行对比,研究结果显示黄芪总提物对于雄性小鼠的抗衰老效果更显著。主要体现在黄芪总提物能够改善雄鼠的脱毛情况,使衰老雄鼠毛发更黑亮,光泽度更好。同时,黄芪总提物对于衰老雄鼠的脏器功能有一定的影响,能够减轻衰老雄鼠的心脏功能,肾脏功能以及肝脏功能损伤,此外,黄芪总提物对于衰老雄鼠的基础代谢也有较好的调控作用,黄芪总提物能够增加其O2,CO2和热量的消耗,提高雄性小鼠的能量消耗。总体而言,黄芪总提物对于18月龄雄鼠的抗衰老作用相较于雌鼠更广泛。对于23月龄衰老小鼠,黄芪多糖与黄芪醇提物对于雌性的药效都优于雄性。2.2不同干预时期对比黄芪早期干预（18月龄）对于衰老小鼠整体表型的改善作用总体而言显著于后期干预（23月龄）,不论性别,因此干预时间的选择也为临床提供了一定的参考。2.3黄芪对于不同衰老表型的作用对比本实验从衰老小鼠整体表型,各脏器功能,能量代谢,系统炎症,肠道功能等多方面进行评价。实验研究结果显示黄芪对于肠道功能的改善作用在多批次的衰老小鼠中作用显著,因此,本实验将进一步探索黄芪改善肠道衰老的作用机制。2.4黄芪不同活性部位药效学对比实验结果证明黄芪总提物对于18月龄雌鼠与雄鼠都有显著的抗衰老药效。在确定黄芪总提物的抗衰老药效后,进一步研究黄芪发挥抗衰老作用的主要活性部位,主要包括黄芪多糖与黄芪醇提物的药效学比较。黄芪多糖对于23月龄雌性小鼠的抗衰老作用显著于黄芪醇提物,具体表现为黄芪多糖能够减轻脾脏重量,降低脾脏指数。同时,在肠道功能方面,相较于黄芪醇提物,黄芪多糖对于衰老小鼠的肠道功能改善作用更显著,衰老小鼠肠道绒毛长度缩短,隐窝深度降低,结肠黏液层厚度变薄,黄芪多糖可以增长绒毛长度,增加隐窝深度以及黏液层厚度。因此,本实验将进一步探索黄芪多糖改善肠道衰老的机制。三、黄芪改善衰老小鼠肠干细胞的机制研究通过以上实验结果可知,本研究将聚焦于肠道衰老,进一步探索黄芪多糖改善肠道衰老的具体机制。肠干细胞是肠道发挥作用的关键性细胞,本研究观察了黄芪对于肠干细胞的影响,实验结果显示黄芪能够上调肠干细胞标志物Lgr5的表达,并且通过TUNEL染色结果可知黄芪不影响肠道细胞的凋亡,但能上调其增殖相关基因KI67的表达。肠干细胞经过不断增殖与分化会形成不同功能性肠道细胞,主要分为分泌型细胞系和吸收型细胞系。分泌型细胞系主要包括杯状细胞、潘氏细胞和内分泌细胞,Muc2、Lyz1和Neurgo3分别是其主要标志物,Atoh1与调控分泌型细胞相关。吸收细胞系主要为肠上皮细胞,其主要标志物为Sis。本研究观察了黄芪对不同类型肠道细胞标志物的作用。结果发现,在23月龄的雌性小鼠空肠中,分泌型细胞的Muc2表达与年轻组相比显著下降,Lyz1无显著性变化,Neurgo3表达显著下降,Atoh1表达无显著性变化。黄芪多糖能显著上调衰老小鼠Muc2与Atoh1的表达,对Lyz1与Neurgo3无显著性影响。对于吸收系的细胞而言,老龄鼠与年轻鼠在Sis基因的表达上无显著性差异,黄芪多糖干预能显著上调Sis的表达。以上结果表明黄芪对于肠道衰老的改善作用可能主要是通过改善肠道干细胞的数量与功能,使肠道发挥更好的作用。我们进一步探讨了黄芪对肠道干细胞相关信号通路的调控作用。WNT信号通路与肠道干细胞增殖密切相关,Axin与Ctnnb1基因是WNT通路相关的下游相关基因。结果发现,在23月龄的雌鼠中,老龄鼠与年轻鼠相比,其空肠Wnt3表达下降,黄芪多糖能够上调Wnt3的表达,但作用不显著。同时,与年轻鼠相比,老年小鼠空肠Axin与Ctnnb1表达无显著性差异,黄芪多糖给药后能显著上调Ctnnb1的表达,对于Axin的表达无影响。以上结果表明黄芪多糖对于WNT信号通路的激活作用不显著。Notch信号通路与肠道干细胞分化相关。Dll1/Dll4是Notch信号通路相关配体,Notch1为接受信号的相关受体,Hes1为其下游目标靶基因。结果显示黄芪多糖可激活Notch信号通路中Notch受体Notch1,Notch1配体D114,对Dll1以及Hes1基因表达无显著性影响,结果表明黄芪多糖对Notch信号通路的激活作用不显著。IL-22信号通路激活可促进肠干细胞的修复。结果发现,黄芪多糖能够激活IL-22信号通路。黄芪多糖能够使小肠中IL-22表达增多,IL-22受体IL-22R1增多,IL-22与其受体结合后会激活STAT3信号,STAT3表达上调,最终调控其下游靶向基因Reg3g,使其表达增多。黄芪多糖可能是通过激活芳香烃受体Ahr导致了 IL-22信号通路的激活。本部分研究结果显示黄芪能够改善衰老小鼠的肠道干细胞,主要通过影响肠道干细胞的增殖而不影响其凋亡,进而对影响肠干细胞的信号通路进行初步探究,结果表明黄芪多糖通过激活IL-22信号通路进一步调控肠道干细胞。四、黄芪对于肠道衰老与肠道菌的关系研究黄芪能够调控衰老小鼠肠道菌群紊乱。黄芪能够改善18月龄雄鼠粪便菌群多样性,显著影响毛螺菌科下细菌的属和种水平细菌丰度。黄芪能够增加18月龄雌鼠粪便菌群中有益菌群,减少有害菌群。黄芪能够上调小肠菌群中乳酸菌科下属和种细菌丰度以及抑制放线菌门和变形菌门下的细菌丰度,改善肠道稳态。通过同笼实验初步探索黄芪是否能够通过调控肠道菌群延缓肠道衰老。将23月龄衰老雌鼠与黄芪多糖干预雌鼠同笼饲养5个月,实验结果表明,在同笼后,同笼衰老组与同笼给药组小鼠肠道菌群在整体性上趋于一致,23月龄衰老雌鼠在整体衰老表型上无显著改善,但对于其肠道功能有一定的影响,同笼衰老组小鼠葡萄糖吸收增多,肠道绒毛长度增长,同时也能上调肠干细胞标志性基因的表达,激活其小肠IL-22信号通路。此外,对同笼小鼠肠道菌群进一步的分析,数据结果显示,同笼衰老组与同笼给药组小鼠乳杆菌科,属以及种细菌丰度显著上升。因此,黄芪可能通过影响肠道菌群中的乳酸杆菌科,属和种细菌激活IL-22信号通路,激活肠干细胞的再生,改善肠道衰老,这与我们前部分的实验结果一致。本研究以黄芪为研究对象,采用自然衰老小鼠模型,观察了黄芪对于衰老的药效学作用,并探讨其与肠道菌群的相关作用,发现黄芪通过发现黄芪通过激活IL-22信号通路促进肠干细胞的再生,改善衰老小鼠肠道功能,并可上调小肠菌群中乳酸杆菌的细菌丰度,恢复肠道菌群稳态,从而发挥其肠道保护的作用,为黄芪抗衰老的临床应用提供参考。