棘孢木霉菌的分离及其生防作用的评价与应用

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木霉菌(Trichoderma spp.)是防治植物病害最重要的生防菌之一,具有很高的开发及应用价值。本研究从长白山自然保护区分离筛选出一株生防木霉菌株,并对该菌株的生物学特性、液-固两相发酵条件及种衣剂的研制进行了研究。具体研究结果如下:1.从长白山自然保护区采集的42份土样中,利用平板稀释涂布法分离得到36株木霉菌菌株。以核盘菌、柑橘炭疽病、玉米纹枯病菌、尖孢镰刀菌、玉米大斑病菌、人参锈腐病菌、禾谷镰刀菌和腐霉菌为靶标菌,采用平板对峙法、对扣培养法和圆盘滤膜法筛选得到6株拮抗效果较好的木霉菌菌株,其中,抑菌效果最好的菌株被命名为T31,其抑菌率为44.5%~77.9%,对玉米大斑病抑制效果最好,为77.91%;在木霉菌的代谢产物中,除核盘菌外,难挥发性代谢产物均能起到重要作用。利用光学显微镜可清晰观测到木霉菌菌株T31对玉米灰斑病菌的重寄生现象。2.对木霉菌菌株T31进行了培养特征、形态学特征及分子生物学鉴定,初步确定木霉菌T31为棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)。3.生物学特性试验结果表明,木霉菌菌株T31的最适培养基为PDA,最适生长温度为25~30℃,最适pH为6.0,持续光照可以促进木霉菌孢子的产生。Zn2+与Ca2+可促进菌丝生长,高浓度的Fe2+和Cu2+则会抑制菌丝生长,Mn2+和Mg2+对孢子的产生有轻微促进作用。4.对木霉菌菌株T31的液体和固体发酵条件进行了优化。液体发酵试验,采用了单因素和正交试验相结合的方法筛选发酵培养基及优化培养条件。结果表明,Richead液体培养基最适合产孢,28℃﹑180r/min条件下,初始接菌量为0.5%﹑装瓶量20mL﹑pH为7.0﹑C:N=5:1的条件是最适合培养木霉菌T31的液体发酵条件。利用Plakett-Burman设计和响应曲面法优化固体发酵条件,自变量分别为氮源添加量(w/w)=0.5%﹑微量元素溶液添加(v/w)=10%﹑基质湿度(v/w)=95%﹑接种量(v/w)=40%﹑基质pH=6.0﹑发酵时间为12d﹑表面活性剂添加量(v/w)=1.5%是最优固体发酵条件,最大分生孢子量可达1.3×1010个/克。5.采用单因素试验筛选了种衣剂助剂。最终选择4%聚乙烯醇:4%壳聚糖=7:3作为成膜剂的配比,各助剂筛选浓度分别为:分散剂=0.3%﹑增粘剂=2%﹑营养剂=0.5%﹑抗冻剂=3%﹑防腐剂=0.3%﹑消泡剂=0.5%。按照各助剂浓度配制种衣剂,测定种衣剂的各项指标均较好,并且对于玉米根腐病的防效达44.3%。6.利用木霉菌种衣剂能够诱导玉米产生对玉米大斑病的系统抗性。实时荧光定量PCR检测发现,玉米植株受玉米大斑病侵染后,叶片中病程相关蛋白PR5和PR10蛋白基因表达量增加,说明木霉菌可以诱导防御反应信号传导,从而激发了对地上部病害的抗性。
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