论文部分内容阅读
目的利用微生物转化来生产γ-氨基丁酸(Gama-aminobutyric, GABA)的过程中的关键酶为谷氨酸脱羧酶简称(Glutamate decarboxylase, GAD)。目前对通过GAD催化法生产GABA的研究主要是在乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)和大肠杆菌(Escherichia coli)这两种菌上,乳酸菌的催化转化生产安全性非常高,但发酵过程比较困难,产量低,成本高。大肠杆菌催化生产GABA研究也比较多,大肠催化产量高,成本低,但发酵过程容易产生内毒素,有安全隐患。对枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis)GAD转化L-谷氨酸产GABA的研究很少。枯草芽孢杆菌广泛应用在食品生产上,是通过美国食品药物管理局(FDA)GRAS认证的安全菌种。所以,要寻求枯草芽孢杆菌这种安全菌种高效的转化生产GABA,为工业发酵生产提供基础。方法本文扩增得到了编码L-谷氨酸脱羧酶的基因gadB,一般它来自于普通的大肠杆菌基因组,从而构建了一株超表达GAD重组芽孢杆菌168/pHT01-gadB工程菌,在该重组菌的基础上对发酵条件进行优化,摇瓶水平上利用通过单次单因子法确定了最佳碳源、最佳有机氮源和最佳无机氮源,再利用二水平正交试验,分析极差得到3个主要影响因子,最后通过Box-Behnken设计(BBD)与响应面法(RSM)对3个因素的交互作用进行研究,利用Design-Expert8.0.6软件,以GAD酶为响应值,进行产酶发酵优化。通过上述方法组合得到的最佳发酵培养基。结论1.本文扩增得到了编码L-谷氨酸脱羧酶的基因gadB,它来自于大肠杆菌基因组,从而构建了一株超表达GAD重组芽孢杆菌168/pHT01-gadB工程菌,超表达GAD基因工程菌的基础。2.摇瓶水平上首先通过单因素法确定了最佳碳源：蔗糖；最佳有机氮源：豆粕；最佳无机氮源：乙酸铵,得到改进的培养基：蔗糖、豆粕、乙酸铵、七水硫酸镁及磷酸二氢钾等主要成分。3.再利用二水平正交试验,分析极差得到3个主要影响因子：蔗糖、磷酸二氢钾及乙酸铵。4.最后通过Box-Behnken设计(BBD)与响应面法(RSM)对3个因素的交互作用进行研究,利用Design-Expert8.0.6软件,以GAD酶为响应值,进行产酶发酵优化。通过上述方法组合得到的最佳培养基(g/L)为：蔗糖23.5,豆粕10、乙酸铵为8.5、磷酸二氢钾4.1、七水硫酸镁0.5,发酵pH=7.0,培养温度37度,摇瓶GAD酶活最高达到0.413U/mL,相比于优化前的GAD酶活为0.143U/mL,酶活增加了约188.8%。5.最优培养基发酵得到工程菌,全细胞催化谷氨酸转化生产GABA,发酵菌体转化实验,5L的发酵罐里面3%湿菌体,60g菌体,2L自来水,一共加入1189g谷氨酸后转化48h,用量筒量转化液为2.7L,最高产量达到239.91g/L,转化谷氨酸的效率为54.48%。6.通过发酵条件的优化,使得发酵酶活提高,确定了最佳发酵参数,摸索出枯草杆菌生产GABA工艺,克服了大肠杆菌安全性的问题和乳酸菌成本过高的问题,表明响应面法可以提高发酵GAD酶活,为工业化发酵生产提供基础。