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背景 我国胃癌死亡率居各类癌症之首，是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤。目前，胃癌常规疗法效果不佳，而且由于缺乏胃癌特异性抗原，尚未研制出一种有效的疫苗用于胃癌免疫治疗。胃癌MG7-Ag是我所发现的较好的胃癌标志物，其抗原决定簇位于糖链上，属于碳水化合物抗原。我们应用噬菌体文库显示技术筛选得到了胃癌MG7-Ag的模拟表位多肽，抗体竞争结合试验证实该多肽具有良好的模拟原始抗原的能力。模拟表位多肽的确定为研制胃癌特异性疫苗奠定了基础。DNA疫苗被称作第三代疫苗，它可以诱导特异、高效、持久的免疫反应，而且制备简便。目前已有骨髓瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌等肿瘤DNA疫苗进入临床试验，结果表明可以诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应，而且安全可靠。DNA疫苗的免疫途径有肌肉注射、皮内注射、皮下注射和基因枪皮肤轰击等。减毒鼠伤寒沙门氏菌是良好的口服疫苗载体，可以诱导体液和细胞免疫反应。最近的研究发现，携带外源基因真核质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服后可以将真核质粒特异地转入脾脏树突状细胞（DC）并被表达。由于DC细胞是职业抗原提呈细胞（APC），以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体构建口服DNA疫苗更有利于诱导机体产生免疫反应。动物试验证实以沙门氏菌为载体的口服DNA疫苗具有良好的抗菌、抗肿瘤保护能力。 为增强DNA疫苗的免疫效能，常用的策略有以下几种：①应用原形或质粒DNA形式的细胞因子佐剂（包括IL-1、IL-12、GM-CSF和IFN-γ等。②将抗原基因与载体蛋白基因融合（如KLH和HBcAg）。③研制 第四军医大学硕土学位论文多表位疫苗（即包含多个抗原表位基因的 DNA疫i）＠利用质粒的兔疫刺激序列如：CpG等。在兔疫应答中，CD4＋辅助性T细胞叮H）有重要作用，有效的激活 CD4＋TH细胞可以增强疫茵诱导的免疫反应。研究表明包括细胞毒性T细胞（CTL）和／或B细胞表位的DNA疫苗中加入TH表位可以增强疫苗的兔疫效能。这是由于：CTL和 TH细胞表位同时提呈至抗原提呈细胞表面可以使TH细胞在CTL细胞邻近发挥辅助作用，从而有效地激活 CTL细胞；TH细胞分泌细胞因子活化 CTL细胞和 B细胞；TH细胞上调APC细胞表面共刺激分子表达，提高APC提呈抗原和激活CTL的能力。现己证实同时包含肿瘤特异性的 CD4＋T细胞表位和 CTL表位（或B细胞表位）的DNA疫苗可以更有效的诱导机体的抗肿瘤免疫反应。1994年，lexander等在多聚丙氨酸骨架中导入 MHC 11分子结合锚定氨基酸，发明了一种通用性 TH表位，称为 PADRE爬an－DR bindingepitope卜PADRE可以与人类多数HLA－DR分子及部分小鼠＊类基因分子结合，在诱导 Th细胞反应的效能方面，PADRE比自然源性 Th表位高 1000倍，且可以诱导 Th和 ThZ型反应。将 PADRE与 CTL表位或 B细胞表位串联构建的多肽疫苗或小基因疫苗可以诱导高效的细胞或体液免疫，而且临床试验证实PADRE对人体安全、无毒、无副作用。由于目前胃癌特异性TH表位尚未确定，PADRE可以作为其替代物研制胃癌特异性DNA疫苗。 目的 以减毒鼠伤寒沙门氏菌为疫苗载体，构建重组胃癌MG7－Ag模拟表位的口服DNA疫苗，观察C57BL／6)小鼠口服免疫后诱导的体液和细胞免疫反应。 方法 将 Hind Ill酶切位点、MG，叭g模拟表位和 MRE编码序列的反向互补序列顺次设计于下游引物中，通过2次聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction PCR），将二种表位连接于一段无关的载体基因，Hind Ill酶切位点位于载体片段与表位基因之间。将目的基因插入 3 第四军医大学硕土学位论文pUCm1载体，酶切鉴定和序列测定证实后，利用pUCm1载体和pcDNA3二l什)载体共有的 Kpn和 ha酶切位点，将目的基因亚克隆入真核表达载体 pcDNA3二什)载体。利用目的基因和 pCDNA3．l什)载体上的Hind Ill酶切点，Hind Ill酶切除载体基因片段，得到胃癌MG卜Ag模拟表位和 PADRE融合基因的真核表达载体。携带绿色荧光蛋白真核质粒pcDNA3．l什)IGFP的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261体外感染小鼠腹腔灌洗巨噬细胞，流式细胞仪检测，验证菌株作为DNA疫苗载体将真核质粒转入 APC细胞的能力＊重组质粒 pCDNA3．1什卜MG7－Ag／PADRE转入减毒鼠伤寒沙门氏菌，构建口服DNA疫苗。用构建的DNA疫苗口服兔疫C57BL历J小鼠，每隔2周加强兔疫一次。以PBS和携带pcDNA3二什)空载体的减毒鼠伤寒沙门氏菌代替口服疫苗接种小鼠作为对照。观察小鼠对疫苗的耐受情况。口服接种6周后应用ELISA ＄检测小鼠血清中抗MG7－Ag抗体的滴度。第8周时取兔疫鼠的脾细胞，加入人工合成的to－xg模拟表位多肽，us－ma掺入检测小鼠脾淋巴细胞对抗原肽刺激的增殖反应，间接反映细胞免疫反应情况。初次免疫8 周后，用表达MG卜Ag的小鼠艾氏腹水瘤细胞进行肿瘤攻击实验，观察疫苗对小鼠的保护作用。 结果 经过2?