【摘 要】
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[目的]大脑中的胶质瘤是神经系统中最为常见的恶性肿瘤之一,传统的治疗以手术加放化疗为主,但治疗效果差,易复发,患者中位生存期短,特别是中高级别浸润性胶质母细胞瘤,治疗方法一直没有突破,为解决这一难题,研究胶质瘤发病的具有重要意义。双特异性磷酸酶10（DUSP10）,又称有丝分裂原活化蛋白激酶磷酸酶5（MKP-5）,属于丝/苏氨酸和酪氨酸双特异性磷酸酶,是DUSP家族中的一员。常通过介导有丝分裂原活
【基金项目】
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云南省科技厅-昆明医科大学联合专项2018FE001（-172）；
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[目的]大脑中的胶质瘤是神经系统中最为常见的恶性肿瘤之一,传统的治疗以手术加放化疗为主,但治疗效果差,易复发,患者中位生存期短,特别是中高级别浸润性胶质母细胞瘤,治疗方法一直没有突破,为解决这一难题,研究胶质瘤发病的具有重要意义。双特异性磷酸酶10（DUSP10）,又称有丝分裂原活化蛋白激酶磷酸酶5（MKP-5）,属于丝/苏氨酸和酪氨酸双特异性磷酸酶,是DUSP家族中的一员。常通过介导有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的去磷酸化而实现对细胞增殖,细胞分化,细胞存活和细胞死亡的调控,与肿瘤的发生发展有着密切的关系。本试验旨在探究了 DUSP10在胶质瘤和正常脑胶质细胞中的表达差异,并通过慢病毒沉默DUSP10在胶质瘤细胞中的表达,分析DUSP10对胶质瘤细胞T98G增殖能力、迁移能力和凋亡的影响。[方法]一.通过生物信息学相关知识,初步探究DUSP10在胶质瘤细胞和正常细胞中的表达差异,利用TCGA和CGGA数据库进行生存曲线分析,研究DUSP10与胶质瘤的相关性。二.运用 RT-q PCR 和 Western blot 技术对 HAC/T98G/U251/U87细胞进行表达量检测,分别从基因和蛋白水平层面来验证DUSP10在各胶质瘤细胞中的表达水平差异。三.通过酶切,连接、转化、抽提等方法构建出具有沉默DUSP10作用的pLK0.1质粒载体,使用慢病毒转导技术实现对T98G细胞系的DUSP10 RNA进行干扰,设置荧光阳性对照组,验证病毒包装和转染情况,并用嘌呤霉素筛选出稳定转染慢病毒的T98G细胞株,运用RT-q PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白水平来验证胶质瘤细胞T98G经干扰后的敲降的效果。四.将胶质瘤细胞 T98G 分为 shRNA-blank 组、shRNA-NC 组 shRNA-DUSP10-1 组、shRNA-DUSP10-2 组,使用 Cell Counting Kit 8（CCK-8）试剂检测法、Transwell小室迁移测定、流式细胞仪检测等试验技术,对以上各组细胞生物功能进行检测,分析DUSP10对胶质瘤细胞T98G增殖、迁移、凋亡方面的影响。五.试验采用SPSS 18.0和Graph Pad Prism7软件进行统计分析和制图,P<0.05表示结果具有统计学意义。[结果]DUSP10在不同的胶质瘤WHO分型中表达量存在差异,随着WHO分型的增高,DUSP10的表达量也随之升高（P<0.05）,并在患者生存性分析中,与DUSP10低表达相比,DUSP10高表达呈现出低生存率趋势（P<0.05）。通过慢病毒转染T98G细胞,再经嘌呤霉素筛选与荧光对照组试验对照表明,慢病毒转染的细胞系构建成功。经 Real-timePCR 和 WesternBlot 试验检测,与 shRNA-blank 组和 shRNA-NC组相比,shRNA-DUSP10-1组和shRNA-DUSP10-2组细胞DUSP10的表达下降（P<0.05）,结果表明RNA干扰效果成功;CCK8试验检测并绘制各组细胞的生长曲线发现,沉默DUSP10后T98G的增殖活性在第二、三天明显下降（P<0.05）;通过Transwell法来检测各不同组T98G的迁移能力,我们发现shRNA-blank组和shRNA-NC组、shRNA-DUSP10-1组、shRNA-DUSP10-2组透过小室细胞均有意义,各组每个视野细胞分别为64±4个、61 ±5个、21±4个和19±4个,与空白对照组和阴性对照组相比,DUSP10两个干扰组的迁移细胞数显著减少,差距有统计学意义（p<0.01）;经流式细胞技术检测细胞凋亡率结果显示:shRNA-blank组、shRNA-NC 组 shRNA-DUSP10-1 组、shRNA-DUSP10-2 组的晚期凋亡率分别为（4.79±0.68）%、（5.13± 1.03）%和（8.94±0.7）%,（8.98±0.85）%,DUSP10 干扰组的晚期凋亡率比空白组和阴性对照组明显增加,差距具有统计学意义（p<0.05）。[结论]DUSP10在各级分型病人中表达存在差异,随着WHO分级的增高而增高,并与患者生存率存在紧密相关,DUSP10表达量越高,患者生存率越低。通过细胞试验我们可以得出,DUSP10在胶质瘤细胞中表达量较正常脑胶质细胞高,沉默DUSP10后可抑制胶质瘤细胞T98G细胞的增殖能力、迁移能力,并能诱导细胞凋亡。
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