论文部分内容阅读
艰难梭菌作为一种重要的人畜共患病病原菌,越来越多的在无症状食品动物中被检出,以及越来越多关于动物源和人类艰难梭菌基因同源的报道,使得了解动物源艰难梭菌的分子流行病学和抗生素耐药性刻不容缓,目前艰难梭菌感染尚未在我国引起足够重视,我国关于动物源艰难梭菌的相关研究仍然空白。因此,本研究采集我国部分地区腹泻食品动物粪便标本,针对性分离艰难梭菌,然后运用毒素基因检测、核糖体分型和抗生素敏感性测定等分子生物学方法,旨在了解动物源艰难梭菌的毒素、分型及耐药性,分析是否存在区域感染暴发流行,为监测我国区域性艰难梭菌流行型别和动物源艰难梭菌耐药性提供数据。2016年3月至2016年8月期间,从广东、湖北、山东、河南等地各大养殖场共采集到腹泻动物(猪、鸡、鸭等)粪便标本538份(其中猪、鸡、鸭的样品数分别为398、121、19),采用芽孢富集法分离艰难梭菌临床分离株。分离到的菌株通过PCR检测毒素A、B编码基因tcdA、tcdB和二元毒素编码基因cdt A/B。然后用核糖体分型(Ribotyping)和MLST对所有菌株进行分子分型,用琼脂稀释法测定艰难梭菌临床分离株对包括甲硝唑、非达霉素、万古霉素、克林霉素等在内的17种抗生素的MICs。从538份粪便样品中共分离到44株艰难梭菌,分离率为8.2%。其中猪源31株,分离率为7.8%;鸭源4株,分离率约为21.1%;鸡源9株,分离率约为7.4%。44株艰难梭菌中有39株为产毒株,14株为A~+B~+CDT~+,占35.89%;13株为A~+B~+,占33.3%;12株为A~-B~+,占30.7%,未检测出A~+B~-菌株。PCR扩增7个管家基因,产物测序以及MLST数据库在线比对得出等位基因值,44株艰难梭菌共分为7个ST型,来源于3个Clade,主要是C lade 1和4。最常见的ST型是ST11(14株)、其次为ST109(9株)、ST35(9株)、ST48(6株)以及ST3(4株)。ST238和ST240各一株,其中ST11,C lade5为二元毒素阳性菌株。通过PCR扩增16 S~23 SrDNA间区序列,一共获得6种不同的核糖体型,按菌株出现先后顺序分别命名为GZ1、GZ2、GZ3、GZ4、GZ5、GZ6。其中GZ2型最多,占31.8%(14/44),其次为GZ1(10株)和GZ3(9株)。核糖体型为GZ4、GZ6的菌株数分别为4株和6株,GZ5只有1株,根据目前世界范围内爆发流行的高毒力致病菌株RT078/ST11的分子特征,经过比较分析确定,GZ2即为RT078型菌株。本研究中所有的菌株都对甲硝唑、非达霉素、万古霉素以及美罗培南敏感,多数菌株对其余抗生素中的三种或四种共同耐药。本研究中的优势型别GZ2(RT078/ST11)主要对头孢西丁、四环素、环丙沙星和亚胺培南4种抗生素共同耐药。本研究首次在我国分离出动物源产二元毒素高毒力艰难梭菌菌株GZ2/ST11(RT078),RT027和RT078是世界范围内爆发流行的高毒力艰难梭菌菌株,揭示了未来我国艰难梭爆发流行的潜在可能,具有非常重要的意义。本实验通过测定艰难梭菌对17种抗生素的MIC值,发现所有的菌株都对甲硝唑、非达霉素、万古霉素以及美罗培南敏感,这些药物仍可作为临床治疗CDI的首选药。