癌症目前仍是医学界最难以治疗的疾病之一,而由其诱发产生的疼痛反应,也是临床上比较常见的一种症状。据统计资料显示,约有50%-70%的癌症病人伴有不同程度的疼痛,尤其到晚期,随着肿瘤细胞的扩散,疼痛进行性加重,给患者的病理及心理造成严重影响,并降低其生活质量。依据WHO倡导的三阶梯疗法,即根据疼痛程度不同给予非甾体类抗炎镇痛药和／或阿片类药物治疗,取得了一定的成效,但由于各种疗法的局限性,仍有部分患者的疼痛得不到有效缓解,使得深入探究癌痛分子机制,寻求缓解癌痛的药物新疗法成为迫切需求。骨癌痛是癌症疼痛的典型代表,也是原发性或转移性骨肿瘤最常见的症状。为方便对癌痛机理的探索,Schwei等在C3H小鼠股骨骨髓腔内接种同源肿瘤细胞溶骨纤维肉瘤细胞NCTC2472首次成功建立小鼠股骨癌痛模型。本实验所用到的小鼠股骨癌痛模型则是在前人的基础上通过改良,将4T1小鼠乳腺癌细胞接种至BALB/c小鼠右侧股骨骨髓腔,成功建立小鼠股骨癌痛模型,并观察到相应的疼痛行为及骨质损伤,为课题的深入探究提供了模型基础。IL-33是近年来新发现的属于IL-1家族的炎性细胞因子,在免疫应答反应过程中通过与ST2膜受体结合,激活NF-KB转录因子,从而诱导多种炎性细胞因子的释放,参与免疫反应过程。IL-33参与多种疾病的发生发展过程,且作用不一。近年来有文献报道IL-33在外周神经系统参与炎症痛的反应过程,但与骨癌痛这种与炎症痛既有区别又有联系的特殊的慢性痛之间的关系目前还鲜有报道。我们实验室前期运用经典福尔马林诱导急性关节炎模型,观察到脊髓IL-33引起痛行为的加剧,而阻断IL-33/ST2信号通路则缓解痛相关行为,说明中枢性IL-33与疼痛也有密切关联。有研究认为IL-33与其受体在中枢均有表达,且主要分布于星形胶质细胞。星形胶质细胞在癌痛模型中存在增生肥大,胶质细胞释放的炎性细胞因子如白细胞介素1beta (Interleukin-lbeta, IL-1β)、白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6).肿瘤坏死因子alpha (Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-a)等表达明显上调,是引起痛觉传递神经元敏化的主要因素,促进中枢敏化形成。那么脊髓IL-33及其受体是否与骨癌痛的发生存在密切联系是本课题研究的中心内容。综上所述,本论文拟开展以下几方面的研究：1、建立小鼠股骨癌痛模型,并对该模型进行行为学、影像学及组织病理学评价。2、运用免疫组织化学方法结合激光共聚焦技术观察IL-33、ST2细胞定位。3、运用RT-PCR、Western Blot、Bio-Plex等技术检测模型鼠脊髓IL-33、ST2及炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、的表达变化。4、用药理学方法或基因敲除方法鞘内阻断ST2受体,检测其对模型小鼠行为学的影响。5、接种4T1肿瘤细胞后WT及ST2-/-小鼠脊髓炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白水平的表达变化。实验结果如下：1、按Schwei等报道的方法,通过改良,向小鼠右侧股骨骨髓腔注入4uL含1×104个4T1小鼠乳腺癌细胞的细胞悬浮液,建立小鼠股骨癌痛模型,并在该模型上观察到随着肿瘤细胞的生长,骨质破坏加重,并伴随有自发痛行为、机械性痛觉超敏及热痛觉过敏的发生。2、运用免疫组织化学法结合激光共聚焦对正常小鼠脊髓IL-33、ST2进行细胞定位,发现IL-33及ST2在星形胶质细胞均有表达,神经元有少量ST2的分布。3、运用RT-PCR、Western Blot、Bio-Plex等技术检测模型鼠术后7天脊髓IL-33、TNF-α、IL-6、及IL-1p的表达与对照组相比均显著提高,一直持续至术后14天,ST2无显著变化。4、鞘内给予ST2受体中和性抗体或敲除ST2受体基因后,机械性痛觉超敏及热痛觉过敏都有不同程度的减弱,其中热痛觉过敏减弱更明显。5、ST2基因敲除小鼠接种4T1肿瘤细胞14天后脊髓炎性细胞因子IL-1β、IL-6、 TNF-α的蛋白表达与正常组相比无显著差异,而野生型接种肿瘤细胞后与正常组比较显著提高。小结：本实验通过将4T1小鼠乳腺癌细胞接种至小鼠股骨骨髓腔建立小鼠骨癌痛模型,随细胞的入侵,骨质破坏情况加重,并在该模型上检测到比较明显的机械性痛觉超敏及热痛觉过敏,说明模型建立成功。IL-33及相关炎性细胞因子在模型鼠上表达上调,将ST2受体外源性阻断或是内源性敲除后,痛行为相对减弱,并且ST2基因敲除小鼠接种肿瘤细胞后与正常组相比炎性细胞因子表达无显著变化,不同于野生型模型小鼠的显著上调。免疫组化结果显示脊髓IL-33及其受体ST2主要表达于星形胶质细胞,ST2还少量表达于神经元,说明IL-33/ST2信号通路有可能通过促进星形胶质细胞释放炎性细胞因子,介导中枢敏化过程,从而参与到股骨癌痛的发生发展过程当中。