摘要猪链球菌(streptococcus suis)是重要的人兽共患传染病病原菌,呈世界分布,在养猪业发达的国家更为广泛。由于毒力因子存在时间和空间的相对性,迄今为止,CPS为唯一得到鉴定的毒力因子,EF.MRP和suilyin(SLY)为比较公认的毒力因子。SLY是猪链球菌株表达的胆固醇依赖的成孔细胞毒素,在猪链球菌中是唯一胆固醇依赖家族成员,是一种分泌蛋白。本研究通过构建sly敲除载体,对2型猪链球菌流行毒力株05ZYH33进行敲除。通过分析比较野生株与突变株△sly生物特性,研究了SLY的毒力功能。且对重组蛋白SLY进行定点突变,获得了具有免疫原性而无溶血活性的SLY点突变重组蛋白。具体结果如下：1.sly基因的敲除及敲除突变株△sly的生物学活性分析以2型猪链球流行毒力菌株05ZYH33为实验材料,克隆sly基因的上,下游片段及氯霉素Cm抗性盒,采用酶切连接将其逐一连到温敏穿梭载体pSET4s。将敲除质粒电击转化导入05ZYH33感受态后,通过同源重组进行敲除,利用抗性筛选获得敲除突变株△sly。△sly与05ZYH33在THB中生长曲线基本重合；△sly上清中检测不到SLY,丧失溶血活性。2.SLY在致病过程中的作用2.1SLY与猪链球菌致病能力相关在ICR小鼠的腹腔感染攻毒致死模型中05ZYH33组全部死亡,Δsly组无小鼠死亡,提示sly与猪链球菌毒力相关。腹腔感染小鼠检测发现血液中菌的含量△sly与05ZYH33有显著差异,静脉感染检测小鼠血液中的菌量无明显差异,提示sly与穿透腹膜屏障有关,与在血中的存活能力关系不大。小鼠腹膜的病理切片显示05ZYH33感染的小鼠腹膜损伤明显,而感染Δsly的损伤却没有那么严重,介于对照组与05ZYH33组之间,进一步证明了上述结论。2.2SLY能刺激炎症因子的释放且与猪链球菌穿过上皮屏障相关与野生株05ZYH33相比,突变株△sly感染ICR小鼠显著地降低了血清中的炎症因子水平,SLY刺激炎症因子释放可能是增加猪链球菌毒力的原因之一。体外实验显示胆固醇和TLR4抑制剂(CLI-095)均能显著地抑制05ZYH33的穿透率,表明SLY有利于通过TLR4途径穿透上皮屏障。3SLY无溶血活性点突变蛋白构建通过定点突变技术对重组SLY质粒的353氨基酸位进行了点突变,获得了三个点突变蛋白,SLY(P353A), SLY(P353L), SLY(P353V)。其中SLY(P353V)完全失去溶血活性。WB和免疫保护实验发现SLY(P353V)和SLY两者的保护能力相当,即SLY(P353V)具有免疫源性而无溶血活性,因此可将其可作为后选疫苗分子进行深入研究。