背景与目的 1997年，H5N1亚型禽流感首次在香港爆发，家禽死亡率高达75％-100％。令人关注的是，这次禽流感的爆发不仅影响家禽，更导致了18例临床感染，其中6例死亡，这是首次禽类流感病毒直接感染人类事件。此后，在2001及2002年，香港地区又有两次高致病性H5N1亚型感染禽类导致家禽死亡的报道。2003年初，香港两名患者确诊为H5N1病毒感染，1人死亡。2003年末至2004年初，H5N1流感病毒肆虐东南亚。这次爆发流行波及9个国家和地区，更有多人感染甚至死亡，其影响面之大为近二十年来所未见。H5N1是否会成为下一次流行性感冒的世界性流行株成为人们关注的焦点。追溯以往三次感染人类的流感大流行，华南地区都是其中不可或缺的一环，许多从事流感病毒研究的科学家认为：华南地区在流感病毒进化演变过程中扮演着重要的角色。此外，香港禽鸟市场上供应的家禽大部分也来自于华南地区，因此，对华南地区的H5N1亚型流感病毒进化进行研究有助于揭示高致病性H5N1的形成及其演变趋势，对该亚型流感病毒爆发进行预测并为疫苗的研制提供支持。自从1997年，香港采取屠宰所有家禽的措施以防止疫情进一步蔓延后，与引起爆发的H5N1(A／Hong Kong／156／97)相同基因组合的病毒未再在香港重现。事件至今已经7年，在华南地区，H5N1发生了怎样的变化?通过在天然基因储存库——水禽中的自由基因组合，产汕头大学医学院硕士学位论文生了哪些新的基因型?这些基因型与刀Hong Kong/156/97是否相同?对人类有没有危险性?各种基因型的流行情况如何?以上种种问题尚待解答。对华南地区水禽中的HSNI流感病毒进行分析将有助于了解我国流感病毒进化的现状，为流感流行的预测打下基础。材料和方法: 在华南地区四个监测点(云南大理、湖南洞庭湖、江西都阳湖、广东汕头)采集的标本常规处理后，接种于9一11日龄鸡胚尿囊腔，35℃恒温培养72小时，收取鸡胚尿囊液。血凝阳性(AD)16)且细菌培养阴性标本进一步做血凝抑制试验(Hemaggl。tinin Inhibition Test，Hl实验)和神经氨酸酶抑制试验(Neuraminidase Inhibition Test，入I实验)以鉴定亚型，标本保存于一70℃冰箱。从中选取27株HSNI病毒代表株进行下一步的分子生物学工作。用Qiagen的RNeasy RNA试剂盒提取病毒RNA后，逆转录合成eDNA。以之为模板，用针对不同基因片段设计的特异性引物，进行PCR反应扩增。以PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，然后进行测序反应。测序在在DNA测序仪 (ABI 377)上进行。用GCG 10.2编辑和处理基因序列。用PAUP 4.1进行进化树分析。在Mega 2.1和Bioedit 5.0.9上进行序列比较和同源性分析。结果: 1、华南地区水禽中存在多种亚型流感病毒，包括HSNI;冬春季是HSNI 亚型流感病毒流行高峰期;近两年来，HSNI的分离率呈急剧上升趋 势。 2、抗原学分析结果表明，根据标本采集时间及基因型的不同，与单克 隆抗体反应时，华南地区HSNI的抗原性可分为高反应组和低反应组; 目前流行的优势基因型(Z型)的抗原性与以往病毒株相比发生了很 大的改变。 3、进化树分析表明，目前华南地区的HSNI流感病毒的HA基因仍来源汕头大学医学院硕士学位论文于A/Goose/GuangDong/l/96(HSNI)(简称Gs/GD)，属欧亚系列;这些因型，HSNI在水禽中与多种亚型流感病毒进行基因重配，形成多种基其中Z型自2002年末开始稳定下来并占主导地位。4、基因分析表明，Dk/ST/l 95/01的8个基因都与Gs/GD高度同源， 很可能是它的后裔。此外，由于它的NA柄部(stalk region)有20 个氨基酸的缺失，根据这一发现可重新探讨HK/ 156/97(简称HSNI/97 样病毒)基因型的形成。5、基因突变分析显示:M基因在各基因型的进化中发挥一定作用。在 MZ氨基酸序列上，S64A和E66A的氨基酸突变使得该基因获得对环 境的适应性。结论: 1、HSNI流感病毒在华南地区水禽中长期广泛存在并与多种其它亚 型流感病毒共存，这种适宜的外环境为HSM的进一步发展、进 化提供了条件; 2、目前在华南地区流行的HSNI病毒，其HA基因仍来自于 A/Goose/Gua。gDong/l/96，从近期爆发记录来看，这些Gs/GD样 HSNI很可能仍是未来几年内威胁家禽的主要亚型，甚至有可能通 过进一步进化而获得感染人的能力，从而导致流感大爆发; 3、自2002年n月起，HSNI各种基因型中的Z基因型开始在水禽中 稳定下来并占主导地位，由于它的抗原性发生了较大的变化，现 有的疫苗将不能提供保护作用; 4、A/HongKong/156/97病毒的NA基因可能来自于类似 Dk/ST/l 95/01的病毒，这类病毒是Gs/GD样病毒的后裔，但NA 基因上有19个氨基酸的缺失; 5、通过对流感病毒的长期监测，我们观察到近两年HSNI病毒的抗 原性和基因型变迁过程，这表明:尽管流感病毒具有很大的变异汕头大学医学院硕士学位论文性，难于控制和预测，长期监测对于探索流感病毒的进化规律、预测流行、研制疫苗等工作仍具重要指导作用。