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牙周病是临床上常见的慢性炎症性疾病,其主要疾病特征是牙体周围结缔组织及其支持骨组织的丧失。目前,越来越多的牙周病患者寻求正畸治疗以改善外观,而牙周病正畸治疗目前在临床上要面临两个病理因素上的难题,即牙周病状态下牙周组织再生能力的下降以及牙周组织对正畸力应答反应的改变。这个现象与牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的功能状态密切相关,其可以促进牙周缺损组织的修复再生,并对力有高度敏感性,在机械刺激介导的牙周组织改建中发挥重要作用。然而,相关研究证实牙周病的炎症微环境会导致PDLSCs成骨分化能力下降,并影响其对力学刺激的应答反应。了解牙周病微环境下PDLSCs对力学刺激的反应及其介导的牙周组织改建过程是进行牙周病正畸治疗的关键,同时也是指导临床正畸治疗中正畸力的合理施加以及促进牙周病患者牙齿移动效率的重要理论基础。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是人类基因组中无蛋白编码能力且长度大于200nt的RNA,其在基因转录与表达的多个层次均可发挥调控作用,从而影响机体生长、发育等重要生命活动以及炎症、肿瘤等疾病的发展和转归。已有大量研究证实,lnc RNA在炎症性疾病的发生发展中发挥重要的调控作用,其对干细胞分化的调控作用也逐渐受到关注,但目前仅有少数lnc RNA在PDLSCs成骨分化过程中的作用机制被阐明,其在机械应力介导的PDLSCs成骨分化过程中的调控作用迄今尚无相关报道。课题组前期研究发现[1],12%的静态牵张力(static mechanical strain,SMS)是促进PDLSCs成骨分化的最佳力值,可在一定程度上反映正常状态下PDLSCs的最适力值加载。基于此背景,本课题拟通过检测12%SMS对健康来源PDLSCs(PDLSCs obtained from healthy periodontal tissues,H-PDLSCs)及炎症来源PDLSCs(PDLSCs obtained from periodontal tissues of periodontitis patients,P-PDLSCs)成骨分化能力的影响,并对12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs中差异表达的lnc RNA进行筛选并确定成骨相关的目标lnc RNA,研究其对12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs成骨分化能力的调控作用,为提高PDLSCs在机械刺激介导下的成骨分化水平及牙周缺损的临床治疗效果提供理论依据。第一部分12%SMS对H-PDLSCs及P-PDLSCs成骨分化能力的影响目的:通过对H-PDLSCs及P-PDLSCs进行分离培养并构建Flexcell牵张力加载装置,探讨12%SMS对H-PDLSCs及P-PDLSCs成骨分化能力的影响。方法:1.分离培养H-PDLSCs及P-PDLSCs,检测干细胞生物活性及多向分化能力。2.构建Flexcell牵张力加载模型,q PCR检测12%SMS作用下H-PDLSCs及PPDLSCs成骨分化能力的变化情况。结果:1.成功培养H-PDLSCs及P-PDLSCs,两者均强阳性表达间充质干细胞表面标记物CD29和CD105,阴性表达造血系标记物CD45和CD34,可在诱导下进行成骨、成脂向分化,但H-PDLSCs的成骨能力及成脂能力均较P-PDLSCs强。2.在12%SMS作用下,H-PDLSCs中成骨基因Runx2、ALP的表达量明显上升,PPDLSCs中成骨基因的表达量无明显变化。结论:1.H-PDLSCs及P-PDLSCs系间充质来源干细胞,具有成骨、成脂多向分化潜能。2.12%SMS对H-PDLSCs及P-PDLSCs的作用有差异,表现为12%SMS对HPDLSCs有显著促进成骨分化的作用,而对P-PDLSCs无促进成骨分化的作用。第二部分12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs中差异表达lnc RNA的筛选及成骨相关lnc RNA的确定目的:构建12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs的lnc RNA表达谱,对差异表达的lnc RNA进行功能分析及验证,并确定成骨相关的目标lnc RNA。方法:1.在H-PDLSCs及P-PDLSCs进行12%SMS加载后,抽提并纯化总RNA,通过芯片杂交洗涤,芯片扫描,图像数据分析获取两种细胞中差异表达lnc RNA的结果并进行KEGG生物学通路分析、GO分析。2.应用q PCR技术对lnc RNA芯片结果进行验证并对成骨相关目标基因进行筛选。结果:1.对12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs样本中变化倍数在2倍以上lnc RNA进行数据分析,结果显示,H-PDLSCs在12%SMS作用下有3920个lnc RNA表达上调,5634个lnc RNA表达下调;P-PDLSCs在12%SMS作用下有4079个lnc RNA表达上调,5817个lnc RNA表达下调。H-PDLSCs在12%SMS作用下有7169个m RNA表达上调,5072个m RNA表达下调;P-PDLSCs在12%SMS作用下有6847个m RNA表达上调,5629个m RNA表达下调。2.GO分析结果显示,在12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs中差异表达的m RNA主要参与生长发育,刺激应答,细胞间信号传递等生物学过程;KEGG生物学通路分析显示,差异表达的m RNA主要参与癌症发生的调控、成骨相关通路如MAPK信号通路、Fox O信号通路等。3.q PCR结果的变化趋势与芯片结果基本一致,仅倍数上略有差异。linc-01135在H-PDLSCs及P-PDLSCs成骨分化前后表达量变化明显,在成骨诱导1d、3d、7d、14d中表达量逐渐升高,且与成骨基因Runx2表达量呈相关关系。Ce RNA分析显示linc-01135与5个成骨相关micro RNA存在结合位点,分别为mi R-17-5p、mi R-22-3p、mi R-211-5p、mi R-106b-5p、mi R-320e。结论1.12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs中存在大量差异表达的lnc RNA。2.linc-01135在H-PDLSCs及P-PDLSCs进行12%SMS加载后差异表达,且与成骨分化相关,存在与成骨相关micro RNA的结合位点,可作为目标lnc RNA。第三部分linc-01135对12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs成骨分化能力的调控作用目的:研究linc-01135对12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs成骨分化能力的调控作用,并探讨炎症微环境对linc-01135表达量及SMS应答反应的影响。方法:1.利用慢病毒稳定上调及下调linc-01135的表达,检测12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs成骨分化能力的变化。2.q PCR检测12%SMS作用下linc-01135在H-PDLSCs及P-PDLSCs中的表达量,并利用外源性炎症因子IL-1β和TNF-α模拟体外炎症微环境,检测在静置及12%SMS作用下linc-01135在H-PDLSCs及P-PDLSCs中表达量的变化情况。结果:1.H-PDLSCs及P-PDLSCs转染上调linc-01135基因表达的慢病毒后,linc-01135表达量明显上升,转染下调linc-01135基因表达的慢病毒后,linc-01135表达量明显降低。2.在H-PDLSCs及P-PDLSCs中上调linc-01135的表达后进行12%SMS加载,Runx2、ALP、OPG的表达量较对照组明显上升;下调linc-01135的表达后进行12%SMS加载,Runx2、ALP、OPG的表达量较对照组明显下降。3.在12%SMS作用下,linc-01135在H-PDLSCs中的表达量明显增加。在H-PDLSCs接受炎症因子干扰后,linc-01135的表达降低,同时其在12%SMS作用下表达量增加的程度较对照组明显降低。结论:1.linc-01135对12%SMS作用下H-PDLSCs及P-PDLSCs的成骨分化能力有积极的调控作用。2.炎症微环境抑制了linc-01135在P-PDLSCs中的表达及其对12%SMS的应答反应。